《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》是石家莊君樂寶乳業有限公司於2011年11月11日申請的專利，該專利的申請號為2011103570588，公布號為CN102373173A，授權公布日為2012年3月14日，發明人是朱宏、王世傑、陸淳、馮麗莉、盧曉莉、康志遠、崔樹勇。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》公開了一種乾酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）N1115、其免疫調節作用及套用。該乾酪乳桿菌是從內蒙古傳統的發酵乳製品中分離出的耐酸和耐膽鹽的益生菌；該菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏編號：CGMCCNo.4691；該發明還提供了乾酪乳桿菌N1115的分離純化方法，分離出的菌株與已有乳酸菌相比，對低pH值和高膽汁酸鹽具有更強的抗性，具有更好的耐受人消化道不良環境的能力，可以更好地發揮其益生作用；該菌株能夠誘導巨噬細胞產生IL-12、IL-6，TNF-α，具有增強免疫調節作用，可用於製備功能性飲品和保健製劑。
2018年12月20日，《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
（概述圖為《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用
- 公告號：CN102373173A
- 授權日：2012年3月14日
- 申請號：2011103570588
- 申請日：2011年11月11日
- 申請人：石家莊君樂寶乳業有限公司
- 地址：河北省石家莊市石銅路68號
- 發明人：朱宏、王世傑、陸淳、馮麗莉、盧曉莉、康志遠、崔樹勇
- Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I; C12N1/02(2006.01)I; A23C9/13(2006.01)I; A23C9/16(2006.01)I等
- 代理機構：石家莊科誠專利事務所
- 代理人：張紅衛、左燕生
- 類別：發明專利
- 生物保藏 ：CGMCC No.4691 2011.03.17
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
截至2011年11月研究發現，含有乳酸菌（LAB）的產品具有保健作用。乳酸菌菌株有幾千種，不同的菌株具有不同的保健作用，其中一些菌株具有增強免疫的保健作用。
乳酸菌對免疫功能的調節作用，與乳酸菌刺激免疫細胞產生細胞因子（例如IL-12、IL-6、TNF-α等）密切相關。
研究發現，乳酸菌具有抗過敏的作用，當它被巨噬細胞或樹突狀細胞等擔任自然免疫的細胞吞噬時，會誘導產生IL-12，IL-12能夠促進未分化T細胞向Ⅰ型的輔助T細胞（即Th1細胞）分化，從而使Th1/Th2平衡向Th1側偏移。而向Ⅱ型的輔助T細胞（即Th2細胞）側偏移的Th1/Th2平衡，誘導產生抗原特異性的IgE，是導致過敏反應發病的一個原因，因此誘導由自然免疫擔任細胞產生IL-12、改善Th1/Th2平衡的活性，就成為評價菌株改善過敏反應效果的一個重要指標。另外，IL-12還是一種T細胞激活因子，可活化T細胞及NK細胞分泌干擾素-γ（INF-γ）和腫瘤壞死因-α（TNF-α）。
IL-6是一種具有促炎症反應和抗炎症反應的雙重作用的細胞因子境淚海。通常，IL-6是由T細胞和巨噬細胞產生，以刺激免疫應答。IL-6作為抗炎性細胞因子，通過激活IL-1受體拮抗物和IL-10，介導實現對TNF-α和IL-1的抑制作用。IL-6與許多疾病過程有關，包括糖尿病、動脈粥樣硬化、抑鬱症、阿耳茨海默氏病（早老性痴呆病）、全身性紅斑狼瘡、前列腺癌等。
TNF-α是腫瘤壞死因子（TNF）的一種。TNF主要由巨噬細胞產生，也可以由淋巴細胞、肥大細胞、成纖維細胞、內皮細胞等其他細胞產生。TNF的主要作用是調節免疫細胞，TNF可以誘導細胞凋亡、誘導炎症，抑制腫瘤發生和病毒複製。TNF通常與IL-1和IL-6協同作用，在不同的組織發揮不同的功能。譽斷灶TNF產生失調與許多人類疾病相關，如阿耳茨海默氏病（早老性痴呆病）、癌症、成年人抑鬱症、腸炎（IBD）等。
乾酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）作為一種益生菌，存在於人類體內時能夠耐受有機體的防禦機制（包括口腔中的酶、胃液中低PH值環境和小腸的膽汁酸等）。
乾酪乳桿菌進入人熱恥踏體後可以在腸道內大量存活，起到調節腸內菌群平衡、促進人體消化吸收等作用，同時具有高效降血壓、降膽固醇、促進細胞分裂、產生抗體免疫、增強人體免疫、預防癌症和抑制腫瘤生長等功能；還具有緩解乳糖不耐症、預防過敏等益生保健作用。
發明內容
專利目的
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》要解決的技術問題，是提供一種新的微生物菌株陵膠遷膠乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N1115，它是從內蒙古傳統的發酵乳製品中分離出來的。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N1115，已於2011年3月17日，在位於北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（國家專利局指定專利微生物保藏中心）進行保藏，保藏編號：CGMCCNo.4691。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的另外一個目的，是提供了乾酪乳桿菌N1115的免疫調節作用，通過培養系統誘導產生了IL-12、IL-6，TNF-α。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》還有一個目的，即提供了上述乾酪乳桿菌N1115免疫調節作用的套用，製備了含有乾酪乳桿菌N1115的酸牛奶、駝悼察陵乳酸菌飲料、菌粉製劑。與已有乳酸菌相比，乾酪乳桿菌N1115對低pH值和高膽汁酸鹽具有更強的抗性，具有更好的耐受人消化道不良環境的能力，可以更好地發揮其益生作用。
技術方案
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》為實現上述目的酷應想，所採用的技術方案是：
一種乾酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）N1115，是從內蒙古傳統的發酵乳製品中分離出的耐酸和耐膽鹽的益生菌；該菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏編號：CGMCCNo.4691。
上述乾酪乳桿菌N1115的分離純化方法，按照如下步驟順序進行：
步驟1 樣品採集
取25毫升內蒙古傳統的發酵乳製品，加入到250毫升生理鹽水中，充分混勻，得到樣品；
步驟2 樣品的富集
取樣品2毫升，加入到100毫升的LC液體培養基中，35℃培養72小時，得到培養液；
步驟3 菌株分離
取培養液1毫升，用0.9%（重量與體積的百分比）無甩地菌的生理鹽水稀釋100000倍，分別為梯度稀釋10、10、10、10、10倍，得到菌懸液；
取MRS瓊脂培養基，融化後，倒入培養皿，待其冷卻、完全凝固後，吸取0.1毫升菌懸液塗布到培養基上；
置35℃環境下厭氧培養72小時（H2：CO2：N2=5：10：85），觀察菌落生長情況；
待平板出現典型菌落後，根據標準乾酪乳桿菌的菌落特徵以及參考相關文獻圖片，挑選出相應的菌落，進行下一步的菌株純化。
步驟4 菌株的純化
挑取選中的單菌落，將菌落培養物劃線接種到MRS瓊脂培養基上，35℃有氧環境培養72小時；然後，再將培養皿上長出的單菌落，繼續劃線接種到MRS瓊脂培養基上，35℃有氧環境培養72小時；連續培養三次；
最後，將挑取的單菌落，進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性、短桿、無芽孢的純化菌株，即為獲得的純培養物，然後，將純培養物置於無菌的20%甘油中在-70℃保存，同時接種MRS瓊脂培養基試管斜面用於臨時保存。
作為《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的一種限定，上述分離純化過程中使用的MRS培養基具有以下組成：酪蛋白腖：10克；牛肉膏：10克；酵母膏：5克；葡萄糖：20克；乙酸鈉：5克；檸檬酸二胺：2克；吐溫-80：1克；K2HPO4：2克；MgSO4·7H2O：0.2克；MnSO4·7H2O：0.05克；瓊脂：15克；蒸餾水：1000毫升；該培養基調節pH6.8±0.1。
作為《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的另一種限定，上述分離純化過程中使用的LC培養基具有以下組成：蛋白腖：10克；酵母膏：1克；牛肉膏：4克；K2HPO4：2克；乙酸鈉：3克；檸檬酸銨：1克；MgSO4·7H2O：0.2克；MnSO4·7H2O：0.05克；乾酪素酸性水解物：1克；吐溫-80：1克；蒸餾水：1000毫升；該培養基調節pH6.0±0.1。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的乾酪乳桿菌N1115的細菌學特徵如下：
一、基本特徵
乾酪乳桿菌N1115的基本特性如表1所示。
表1.N1115基本特性
試驗項目 | 結果 | 試驗項目 | 結果 | 試驗項目 | 結果 |
革蘭氏染色 | ＋ | 空氣中生長 | ＋ | 10℃發酵 | ＋ |
細胞形態 | 短桿 | 6.5%NaCl生長 | ＋ | 15℃發酵 | ＋ |
形成芽孢 | － | pH9.6生長 | － | 45℃發酵 | － |
接觸酶 | － | pH4.5生長 | ＋ | 10%牛奶發酵 | ＋ |
氧化酶 | － | 發酵葡萄糖產氣 | － | / | / |
由表1可見，乾酪乳桿菌N1115為革蘭氏陽性、短桿、無芽胞、接觸酶和氧化酶試驗陰性菌株；該菌株可在空氣、6.5%NaCl、pH9.6或pH4.5的條件下生長；該菌株發酵葡萄糖產氣試驗陰性，可在10%牛奶中發酵，可在10℃和15℃條件下發酵，但不能45℃條件下發酵。
二、生化特徵
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的菌株乾酪乳桿菌N1115是一種兼性厭氧菌，在35℃顯示出最佳的生長能力。在牛乳培養基中（10%的脫脂乳），顯示出了較好的產酸能力，可在48小時內凝乳。《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》套用梅里埃公司生產的API50CH試劑條對所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115進行了糖發酵特性的檢測，其原理是以基礎培養基做基礎，分別添加不同的碳水化合物，然後接種乾酪乳桿菌N1115，觀察其發酵產酸特性；其中，基礎培養基由以下成分組成：硫酸銨：2克；酵母膏：0.5克；胰蛋白腖：1克；酚紅：0.18克；無機鹽基礎：10毫升，pH7.8的磷酸緩衝液：1000毫升。
結果顯示：乾酪乳桿菌N1115可以很好地利用核糖、半乳糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、D-塔格糖、.D-松二糖、松三糖、N-乙醯-葡糖胺、葡萄糖酸鹽作為碳源，套用柳醇、纖維二糖、蔗糖、攏牛兒糖的能力較弱，不能利用甘油、赤蘚糖、D-阿拉伯糖、.L-阿拉伯糖等。具體檢測結果如表2所示。
表2.LactobacilluscaseiN1115的Api50鑑定結果 
註：“+”表示發酵；“－”表示不發酵。
三、基因特徵
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》所提供的菌株N1115菌株，套用PCR對其16SrDNA測序，結果如下：
套用PCR對其延長因子Tuf基因進行測序，結果如下： 
根據《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》乾酪乳桿菌N1115的上述16SrDNA序列和延長因子Tuf基因序列，可以確定：乾酪乳桿菌N1115是一株新穎的乾酪乳桿菌菌株。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》還提供了乾酪乳桿菌N1115的免疫調節作用，該菌具有誘導巨噬細胞產生IL-12、IL-6，TNF-α的能力及用途。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》還提供了乾酪乳桿菌N1115免疫調節作用的套用，用於生產益生菌飲品、菌粉製劑。
改善效果
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》所提供的乾酪乳桿菌N1115具有誘導巨噬細胞產生IL-12、IL-6、TNF-α的能力及用途，從而使其具有調節免疫功能的作用；《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》還提供了乾酪乳桿菌N1115調節免疫功能的套用，用於生產益生菌製劑和含有這該乳酸菌的食品。實踐證明，乾酪乳桿菌N1115與已有乳酸菌相比，對低pH值和高膽汁酸鹽具有更強的抗性，具有更好的耐受人消化道不良環境的能力，可以更好地發揮其益生作用。
附圖說明
圖1—圖3分別是《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》乾酪乳桿菌N1115刺激產生IL-12、IL-6、TNF-a濃度的檢測圖。
技術領域
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》屬於微生物工程領域，涉及一種乳酸菌的新菌株，具體地說是一種乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N1115、其免疫調節作用及套用。
權利要求
1.一種乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N1115，該菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏編號：CGMCCNo.4691。
2.根據權利要求1所述的乾酪乳桿菌N1115的套用，其特徵在於：該乾酪乳桿菌套用於製備酸牛奶及乳酸菌飲料。
實施方式
- 實施例一 樣品的採集和分離
步驟1 樣品採集
取25毫升內蒙古傳統的發酵乳製品，加入到250毫升生理鹽水中，充分混勻，得到樣品。
步驟2 樣品的富集
取樣品2毫升，加入到100毫升的LC液體培養基中，35℃培養72小時，得到培養液。
步驟3 菌株分離
取培養液1毫升，用0.9%（重量與體積的百分比）無菌的生理鹽水稀釋100000倍，分別為梯度稀釋10、10、10、10、10倍，得到菌懸液；
取MRS瓊脂培養基融化後，倒入培養皿，待其冷卻、完全凝固後，吸取0.1毫升菌懸液塗布到培養基上。置35℃環境下厭氧培養72小時（H2：CO2：N2=5：10：85）。觀察菌落生長情況，待平板出現典型菌落後，根據標準乾酪乳桿菌的菌落特徵以及參考相關文獻圖片，挑選出相應的菌落，進行下一步的菌株純化。
步驟4 菌株的純化
挑取選中的單菌落，將菌落培養物劃線接種到MRS瓊脂培養基上，35℃有氧環境培養72小時；然後，再將培養皿上長出的單菌落，繼續劃線接種到MRS瓊脂培養基上，35℃有氧環境培養72小時，重複三次；最後，將挑取的單菌落，進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性、短桿、無芽孢的純化菌株，即為獲得的純培養物，然後，將純培養物置於無菌的20%甘油中在-70℃保存，同時接種MRS瓊脂培養基試管斜面用於臨時保存。
上述分離純化過程中使用的MRS培養基具有以下組成：
酪蛋白腖：10克；牛肉膏：10克；酵母膏：5克；葡萄糖：20克；乙酸鈉：5克；檸檬酸二胺：2克；吐溫-80：1克；K2HPO4：2克；MgSO4·7H2O：0.2克；MnSO4·7H2O：0.05克；瓊脂：15克；蒸餾水：1000毫升；該培養基調節pH6.8±0.1。
上述分離純化過程中使用的LC培養基具有以下組成：
蛋白腖：10克；酵母膏：1克；牛肉膏：4克；K2HPO4：2克；乙酸鈉：3克；檸檬酸銨：1克；MgSO4·7H2O：0.2克；MnSO4·7H2O：0.05克；乾酪素酸性水解物：1克；吐溫-80：1克；蒸餾水：1000毫升；該培養基調節pH6.0±0.1。
- 實施例二 細菌學特徵
一、基本特徵
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115的基本特性如表1所示。
表1.乾酪乳桿菌N1115基本特性
試驗項目 | 結果 | 試驗項目 | 結果 | 試驗項目 | 結果 |
革蘭氏染色 | ＋ | 空氣中生長 | ＋ | 10℃發酵 | ＋ |
細胞形態 | 短桿 | 6.5%NaCl生長 | ＋ | 15℃發酵 | ＋ |
形成芽孢 | － | pH9.6生長 | － | 45℃發酵 | － |
接觸酶 | － | pH4.5生長 | ＋ | 10%牛奶發酵 | ＋ |
氧化酶 | － | 發酵葡萄糖產氣 | － | / | / |
由表1可見，乾酪乳桿菌N1115為革蘭氏陽性、短桿、無芽胞、接觸酶和氧化酶試驗陰性菌株；該菌株可在空氣、6.5%NaCl、pH9.6或pH4.5的條件下生長；該菌株發酵葡萄糖產氣試驗陰性，可在10%牛奶中發酵，可在10℃和15℃條件下發酵，但不能在45℃條件下發酵。
二、生化特徵
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的菌株乾酪乳桿菌N1115是一種兼性厭氧菌，在35℃顯示出最佳的生長能力。在牛乳培養基中（10%的脫脂乳），顯示出了較好的產酸能力，可在48小時內凝乳。《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》套用梅里埃公司生產的API50CH試劑條對所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115進行了糖發酵特性的檢測，其原理是以基礎培養基做基礎，分別添加不同的碳水化合物，然後接種乾酪乳桿菌N1115，觀察其發酵產酸特性；其中基礎培養基由以下成分組成：硫酸銨：2克；酵母膏：0.5克；胰蛋白腖：1克；酚紅：0.18克；無機鹽基礎：10毫升，pH7.8的磷酸緩衝液：1000毫升。
結果顯示：乾酪乳桿菌N1115可以很好地利用核糖、半乳糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、D-塔格糖、.D-松二糖、松三糖、N-乙醯-葡糖胺、葡萄糖酸鹽作為碳源，套用柳醇、纖維二糖、蔗糖、攏牛兒糖的能力較弱，不能利用甘油、赤蘚糖、D-阿拉伯糖、.L-阿拉伯糖等。具體檢測結果如表2所示。
表2.乾酪乳桿菌N1115的Api50鑑定結果
註：“+”表示發酵；“－”表示不發酵。
三、基因特徵
該實施例所提供的乾酪乳桿菌N1115菌株，套用PCR對其16SrDNA測序，結果如下：
套用PCR對其延長因子Tuf基因進行測序，結果如下： 
根據該實施例乾酪乳桿菌N1115的上述16SrDNA序列和延長因子Tuf基因序列，可以確定：乾酪乳桿菌N1115是一株新穎的乾酪乳桿菌菌株。
- 實施例 三急性毒理學試驗
該實施例所提供的菌株N1115經急性毒性試驗（GB15193.3—2003）檢測無毒副作用，其中小鼠急性經口毒性試驗結果如表3所示。實驗採用的試驗樣品按所需劑量用牛奶配置，其中菌株N1115的濃度為7.0×10細菌群落總數每毫升；所用小鼠為河北省動物中心提供的清潔級昆明小鼠（試驗動物許可證好：KM1107023）20隻，體重18-22克，雌雄各半。
實驗方法採用一次最大限量法，選用昆明種小鼠20隻，劑量為10000毫克/千克體重。動物實驗前禁食過夜。染毒後，觀察小鼠的一般情況，中毒症狀和死亡情況，觀察期限14天。根據試驗結果計算LD50，並確定急性毒性分級。
結果顯示，染毒後，動物無不良反應、中毒表現和死亡情況出現。觀察期滿，處死所有動物，並進行解剖，經肉眼觀察未發現異常的組織或臟器。雄性動物：LD50＞10000毫克/千克體重；雌性動物：LD50＞10000毫克/千克體重。按急性毒性分級LD50＞10000毫克/千克體重，該受試物屬於無毒物。
表3.乾酪乳桿菌N1115（7.0×10細菌群落總數每毫升）小鼠急性經口毒性試驗 
- 實施例四 菌株的抗藥性特徵
該實施例對乾酪乳桿菌N1115進行了耐藥性試驗（試驗結果參考表4）乾酪乳桿菌N1115耐藥性檢測：採用“抗生素類藥敏紙片”（杭州天和微生物試劑有限公司）紙片方法，通過檢測抑菌圈的大小檢測菌株對抗生素的抗藥性。
結果顯示：乾酪乳桿菌N1115對青黴素類、β-內醯胺/β-內醯胺酶抑制劑複合物、頭孢類、單環內醯胺類、等27種抗生素的檢測結果均為陰性，表明乾酪乳桿菌N1115對該27中抗生素沒有抗藥性。
表4.乾酪乳桿菌N1115耐藥性檢測 
- 實施例五 乾酪乳桿菌N1115耐酸耐膽鹽特性
該實施例對所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115進行了耐酸耐膽鹽實驗。挑取1接種環菌株接種到MRS培養基中，培養35℃、72小時，取出計數；同時，各取1毫升該發酵液，分別加入pH2.0磷酸鹽緩衝液中（37℃孵育2小時），和3‰的豬膽鹽溶液（35℃孵育6小時），取出後，立即進行梯度稀釋（0.85%滅菌生理鹽水），進行菌落培養計數，計算其存活率。
乾酪乳桿菌N1115耐受酸和膽鹽的特性參考表5。結果顯示，乾酪乳桿菌N1115具有同時耐酸和耐膽鹽的特性，酸液處理後的存活率為22.92‰，膽鹽溶液處理後的存活率為0.83‰。
表5.乾酪乳桿菌N1115耐受酸和膽鹽的特性 
- 實施例六 乾酪乳桿菌N1115的API20結果
該實施例對所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115進行了酶活性研究。通過生物梅里埃公司（ApIbioMerieuxltd.）的半定量ApIZym試紙條，共檢測了19種酶的活性，分別是：Alkakinphosphatase（鹼性磷酸酶）、Esterase（酯酶）、Esteraselipase（酯酶脂酶）、Lipase（脂肪酶）、Leucinearylamidase（亮氨酸氨基肽酶）、Valinearylamidase（纈氨酸芳基醯胺酶）、Cystinearylamidase（胱氨酸芳基醯胺酶）、Trypsin（胰蛋白酶）、Chymotrypsin（糜凝乳蛋白酶）、Acidphosphatase（酸性磷酸酯酶）、Phosphoamidase（磷醯化酶）、ɑ-Galactosidase（ɑ-半乳糖苷酶）、ß-Galactosidase（ß-半乳糖苷酶）ß-Glucuronidase（ß-葡糖醛酸糖苷酶）ɑ-Glucosidase（ɑ-（葡萄）糖苷酶）、ß-Glucosidase（ß-（葡萄）糖苷酶）、N-acetyl-β-glucosaminidase（N-乙醯-β-葡萄糖苷酶）、ɑ-Mnnosidase（α-甘露糖苷酶）、ɑ-Fucosidase（ɑ-岩藻糖苷酶）。
乾酪乳桿菌N1115在瓊脂MRS培養基斜面上35℃培養72小時；用液體MRS培養基將其沖洗下來，調節乾酪乳桿菌N1115濃度為10細菌群落總數每毫升，得菌懸液；根據操作手冊，取65µl乾酪乳桿菌N1115菌懸液分別加入到試劑孔中，所有試劑條放置到35℃條件孵育24小時；接著加入API試劑ZyM1和ZyM2，然後，通過試劑盒廠家提供的比色表，進行酶活性的讀數（樣品中酶的濃度以納摩爾來表示），結果如表6所示。
表6.乾酪乳桿菌N1115的酶活性測定 
由表6可見，乾酪乳桿菌N1115具有較高的Leucinearylamidase（亮氨酸氨基肽酶）、Valinearylamidase（纈氨酸芳基醯胺酶）、ɑ-Glucosidase（ɑ-（葡萄）糖苷酶）活性，其次為Esterase（酯酶）、Esteraselipase（酯酶脂酶）ß-Galactosidase（ß-半乳糖苷酶）、Acidphosphatase（酸性磷酸酯酶）的活性。
- 實施例七 乾酪乳桿菌N1115刺激產生IL-12、IL-6、TNF-a的能力
該實施例所提供乾酪乳桿菌N1115可以同時刺激小鼠巨噬細胞株（J774.1）產生IL-12、IL-6、TNF-a。乾酪乳桿菌N1115首先在MRS培養基中培養，35℃，培養72小時；然後將其用磷酸鹽緩衝液（pH7.1）洗脫下來，離心清洗2-3次。最後將離心下來的N1115懸浮於RPMI1640培養基（Sigma公司，StLouis，MO，美國）中，菌懸液濃度為10細菌群落總數每毫升。
細胞株J744.1分別加入到24孔圓底的細胞培養板中，使每孔中的細胞濃度為5×105細胞/2毫升；在每孔中添加100µl滅活的乾酪乳桿菌N1115菌懸液，放置到37℃，5%CO2的二氧化碳培養箱，孵育4小時；收集上層液體，放置於-70℃的冰櫃中用於分析。L-12、IL-6、TNF-a濃度（單位為匹克/毫升）的檢測套用商業ELISA檢測試劑盒來進行，檢測結果參考圖1—圖3。
- 實施例八 具有免疫調節作用、含乾酪乳桿菌N1115菌株的酸牛奶的製備
其製備方法如下：
將鮮牛奶加熱到50-60℃，加入白砂糖（與牛奶的重體積比為6%~8%，單位克/毫升），攪拌至完全溶解，預熱至60℃左右，20兆帕壓力下均質，95℃殺菌5分鐘，冷卻至35℃~40℃，接種乾酪乳桿菌N1115，接種量1×10細菌群落總數每毫升以上。35℃~40℃發酵（發酵的同時加攪拌），至pH值為4.0~4.5即得含有活性乾酪乳桿菌N1115的優酪乳（存放條件：需於4℃冷藏）。
- 實施例九 具有免疫調節作用、含乾酪乳桿菌N1115菌株乳酸菌飲料的製備
取實施例八製備好的優酪乳，用製備好的稀釋液稀釋2-3倍，混合均勻，即可製成可直接飲用的乳酸菌飲料，4℃保存。
稀釋液製備方法如下：95℃熱水895克，加入糖漿100克，CMC（羧甲基纖維素鈉）：5克，攪拌混勻，在90℃以上的條件下，保持20分鐘，然後將溫至40℃，即可作為可使用的稀釋液。
- 實施例十 具有免疫調節作用、含乾酪乳桿菌N1115菌株製劑的製備方法
乾酪乳桿菌N1115首先在MRS培養基中培養，35℃，培養48小時~72小時；取發酵液1000毫升，用冷凍離心機離心（溫度：4℃，離心時間：10分鐘，離心力：3000克），獲得濃縮的乾酪乳桿菌N1115發酵液，然後將其冷凍至-40℃~-60℃放置24小時，經冷凍乾燥機乾燥，至含水量為3%~5%，壓碎成粉末狀；將上述粉末加入到奶粉、豆粉等產品中製成粉末狀或片、塊狀產品。
此外，根據該實施例，該乳酸菌可添加到人們常用的藥物組合物、營養補充品、食品、保健食品、醫療食品或其組分中。
榮譽表彰
2018年12月20日，《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
乾酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）作為一種益生菌，存在於人類體內時能夠耐受有機體的防禦機制（包括口腔中的酶、胃液中低PH值環境和小腸的膽汁酸等）。
乾酪乳桿菌進入人體後可以在腸道內大量存活，起到調節腸內菌群平衡、促進人體消化吸收等作用，同時具有高效降血壓、降膽固醇、促進細胞分裂、產生抗體免疫、增強人體免疫、預防癌症和抑制腫瘤生長等功能；還具有緩解乳糖不耐症、預防過敏等益生保健作用。
發明內容
專利目的
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》要解決的技術問題，是提供一種新的微生物菌株乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N1115，它是從內蒙古傳統的發酵乳製品中分離出來的。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N1115，已於2011年3月17日，在位於北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（國家專利局指定專利微生物保藏中心）進行保藏，保藏編號：CGMCCNo.4691。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的另外一個目的，是提供了乾酪乳桿菌N1115的免疫調節作用，通過培養系統誘導產生了IL-12、IL-6，TNF-α。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》還有一個目的，即提供了上述乾酪乳桿菌N1115免疫調節作用的套用，製備了含有乾酪乳桿菌N1115的酸牛奶、乳酸菌飲料、菌粉製劑。與已有乳酸菌相比，乾酪乳桿菌N1115對低pH值和高膽汁酸鹽具有更強的抗性，具有更好的耐受人消化道不良環境的能力，可以更好地發揮其益生作用。
技術方案
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》為實現上述目的，所採用的技術方案是：
一種乾酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）N1115，是從內蒙古傳統的發酵乳製品中分離出的耐酸和耐膽鹽的益生菌；該菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏編號：CGMCCNo.4691。
上述乾酪乳桿菌N1115的分離純化方法，按照如下步驟順序進行：
步驟1 樣品採集
取25毫升內蒙古傳統的發酵乳製品，加入到250毫升生理鹽水中，充分混勻，得到樣品；
步驟2 樣品的富集
取樣品2毫升，加入到100毫升的LC液體培養基中，35℃培養72小時，得到培養液；
步驟3 菌株分離
取培養液1毫升，用0.9%（重量與體積的百分比）無菌的生理鹽水稀釋100000倍，分別為梯度稀釋10、10、10、10、10倍，得到菌懸液；
取MRS瓊脂培養基，融化後，倒入培養皿，待其冷卻、完全凝固後，吸取0.1毫升菌懸液塗布到培養基上；
置35℃環境下厭氧培養72小時（H2：CO2：N2=5：10：85），觀察菌落生長情況；
待平板出現典型菌落後，根據標準乾酪乳桿菌的菌落特徵以及參考相關文獻圖片，挑選出相應的菌落，進行下一步的菌株純化。
步驟4 菌株的純化
挑取選中的單菌落，將菌落培養物劃線接種到MRS瓊脂培養基上，35℃有氧環境培養72小時；然後，再將培養皿上長出的單菌落，繼續劃線接種到MRS瓊脂培養基上，35℃有氧環境培養72小時；連續培養三次；
最後，將挑取的單菌落，進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性、短桿、無芽孢的純化菌株，即為獲得的純培養物，然後，將純培養物置於無菌的20%甘油中在-70℃保存，同時接種MRS瓊脂培養基試管斜面用於臨時保存。
作為《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的一種限定，上述分離純化過程中使用的MRS培養基具有以下組成：酪蛋白腖：10克；牛肉膏：10克；酵母膏：5克；葡萄糖：20克；乙酸鈉：5克；檸檬酸二胺：2克；吐溫-80：1克；K2HPO4：2克；MgSO4·7H2O：0.2克；MnSO4·7H2O：0.05克；瓊脂：15克；蒸餾水：1000毫升；該培養基調節pH6.8±0.1。
作為《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的另一種限定，上述分離純化過程中使用的LC培養基具有以下組成：蛋白腖：10克；酵母膏：1克；牛肉膏：4克；K2HPO4：2克；乙酸鈉：3克；檸檬酸銨：1克；MgSO4·7H2O：0.2克；MnSO4·7H2O：0.05克；乾酪素酸性水解物：1克；吐溫-80：1克；蒸餾水：1000毫升；該培養基調節pH6.0±0.1。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的乾酪乳桿菌N1115的細菌學特徵如下：
一、基本特徵
乾酪乳桿菌N1115的基本特性如表1所示。
表1.N1115基本特性
試驗項目 | 結果 | 試驗項目 | 結果 | 試驗項目 | 結果 |
革蘭氏染色 | ＋ | 空氣中生長 | ＋ | 10℃發酵 | ＋ |
細胞形態 | 短桿 | 6.5%NaCl生長 | ＋ | 15℃發酵 | ＋ |
形成芽孢 | － | pH9.6生長 | － | 45℃發酵 | － |
接觸酶 | － | pH4.5生長 | ＋ | 10%牛奶發酵 | ＋ |
氧化酶 | － | 發酵葡萄糖產氣 | － | / | / |
由表1可見，乾酪乳桿菌N1115為革蘭氏陽性、短桿、無芽胞、接觸酶和氧化酶試驗陰性菌株；該菌株可在空氣、6.5%NaCl、pH9.6或pH4.5的條件下生長；該菌株發酵葡萄糖產氣試驗陰性，可在10%牛奶中發酵，可在10℃和15℃條件下發酵，但不能45℃條件下發酵。
二、生化特徵
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的菌株乾酪乳桿菌N1115是一種兼性厭氧菌，在35℃顯示出最佳的生長能力。在牛乳培養基中（10%的脫脂乳），顯示出了較好的產酸能力，可在48小時內凝乳。《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》套用梅里埃公司生產的API50CH試劑條對所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115進行了糖發酵特性的檢測，其原理是以基礎培養基做基礎，分別添加不同的碳水化合物，然後接種乾酪乳桿菌N1115，觀察其發酵產酸特性；其中，基礎培養基由以下成分組成：硫酸銨：2克；酵母膏：0.5克；胰蛋白腖：1克；酚紅：0.18克；無機鹽基礎：10毫升，pH7.8的磷酸緩衝液：1000毫升。
結果顯示：乾酪乳桿菌N1115可以很好地利用核糖、半乳糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、D-塔格糖、.D-松二糖、松三糖、N-乙醯-葡糖胺、葡萄糖酸鹽作為碳源，套用柳醇、纖維二糖、蔗糖、攏牛兒糖的能力較弱，不能利用甘油、赤蘚糖、D-阿拉伯糖、.L-阿拉伯糖等。具體檢測結果如表2所示。
表2.LactobacilluscaseiN1115的Api50鑑定結果
註：“+”表示發酵；“－”表示不發酵。
三、基因特徵
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》所提供的菌株N1115菌株，套用PCR對其16SrDNA測序，結果如下：
套用PCR對其延長因子Tuf基因進行測序，結果如下：
根據《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》乾酪乳桿菌N1115的上述16SrDNA序列和延長因子Tuf基因序列，可以確定：乾酪乳桿菌N1115是一株新穎的乾酪乳桿菌菌株。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》還提供了乾酪乳桿菌N1115的免疫調節作用，該菌具有誘導巨噬細胞產生IL-12、IL-6，TNF-α的能力及用途。
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》還提供了乾酪乳桿菌N1115免疫調節作用的套用，用於生產益生菌飲品、菌粉製劑。
改善效果
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》所提供的乾酪乳桿菌N1115具有誘導巨噬細胞產生IL-12、IL-6、TNF-α的能力及用途，從而使其具有調節免疫功能的作用；《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》還提供了乾酪乳桿菌N1115調節免疫功能的套用，用於生產益生菌製劑和含有這該乳酸菌的食品。實踐證明，乾酪乳桿菌N1115與已有乳酸菌相比，對低pH值和高膽汁酸鹽具有更強的抗性，具有更好的耐受人消化道不良環境的能力，可以更好地發揮其益生作用。
附圖說明
圖1—圖3分別是《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》乾酪乳桿菌N1115刺激產生IL-12、IL-6、TNF-a濃度的檢測圖。
技術領域
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》屬於微生物工程領域，涉及一種乳酸菌的新菌株，具體地說是一種乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N1115、其免疫調節作用及套用。
權利要求
1.一種乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei）N1115，該菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏編號：CGMCCNo.4691。
2.根據權利要求1所述的乾酪乳桿菌N1115的套用，其特徵在於：該乾酪乳桿菌套用於製備酸牛奶及乳酸菌飲料。
實施方式
- 實施例一 樣品的採集和分離
步驟1 樣品採集
取25毫升內蒙古傳統的發酵乳製品，加入到250毫升生理鹽水中，充分混勻，得到樣品。
步驟2 樣品的富集
取樣品2毫升，加入到100毫升的LC液體培養基中，35℃培養72小時，得到培養液。
步驟3 菌株分離
取培養液1毫升，用0.9%（重量與體積的百分比）無菌的生理鹽水稀釋100000倍，分別為梯度稀釋10、10、10、10、10倍，得到菌懸液；
取MRS瓊脂培養基融化後，倒入培養皿，待其冷卻、完全凝固後，吸取0.1毫升菌懸液塗布到培養基上。置35℃環境下厭氧培養72小時（H2：CO2：N2=5：10：85）。觀察菌落生長情況，待平板出現典型菌落後，根據標準乾酪乳桿菌的菌落特徵以及參考相關文獻圖片，挑選出相應的菌落，進行下一步的菌株純化。
步驟4 菌株的純化
挑取選中的單菌落，將菌落培養物劃線接種到MRS瓊脂培養基上，35℃有氧環境培養72小時；然後，再將培養皿上長出的單菌落，繼續劃線接種到MRS瓊脂培養基上，35℃有氧環境培養72小時，重複三次；最後，將挑取的單菌落，進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性、短桿、無芽孢的純化菌株，即為獲得的純培養物，然後，將純培養物置於無菌的20%甘油中在-70℃保存，同時接種MRS瓊脂培養基試管斜面用於臨時保存。
上述分離純化過程中使用的MRS培養基具有以下組成：
酪蛋白腖：10克；牛肉膏：10克；酵母膏：5克；葡萄糖：20克；乙酸鈉：5克；檸檬酸二胺：2克；吐溫-80：1克；K2HPO4：2克；MgSO4·7H2O：0.2克；MnSO4·7H2O：0.05克；瓊脂：15克；蒸餾水：1000毫升；該培養基調節pH6.8±0.1。
上述分離純化過程中使用的LC培養基具有以下組成：
蛋白腖：10克；酵母膏：1克；牛肉膏：4克；K2HPO4：2克；乙酸鈉：3克；檸檬酸銨：1克；MgSO4·7H2O：0.2克；MnSO4·7H2O：0.05克；乾酪素酸性水解物：1克；吐溫-80：1克；蒸餾水：1000毫升；該培養基調節pH6.0±0.1。
- 實施例二 細菌學特徵
一、基本特徵
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115的基本特性如表1所示。
表1.乾酪乳桿菌N1115基本特性
試驗項目 | 結果 | 試驗項目 | 結果 | 試驗項目 | 結果 |
革蘭氏染色 | ＋ | 空氣中生長 | ＋ | 10℃發酵 | ＋ |
細胞形態 | 短桿 | 6.5%NaCl生長 | ＋ | 15℃發酵 | ＋ |
形成芽孢 | － | pH9.6生長 | － | 45℃發酵 | － |
接觸酶 | － | pH4.5生長 | ＋ | 10%牛奶發酵 | ＋ |
氧化酶 | － | 發酵葡萄糖產氣 | － | / | / |
由表1可見，乾酪乳桿菌N1115為革蘭氏陽性、短桿、無芽胞、接觸酶和氧化酶試驗陰性菌株；該菌株可在空氣、6.5%NaCl、pH9.6或pH4.5的條件下生長；該菌株發酵葡萄糖產氣試驗陰性，可在10%牛奶中發酵，可在10℃和15℃條件下發酵，但不能在45℃條件下發酵。
二、生化特徵
《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》的菌株乾酪乳桿菌N1115是一種兼性厭氧菌，在35℃顯示出最佳的生長能力。在牛乳培養基中（10%的脫脂乳），顯示出了較好的產酸能力，可在48小時內凝乳。《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》套用梅里埃公司生產的API50CH試劑條對所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115進行了糖發酵特性的檢測，其原理是以基礎培養基做基礎，分別添加不同的碳水化合物，然後接種乾酪乳桿菌N1115，觀察其發酵產酸特性；其中基礎培養基由以下成分組成：硫酸銨：2克；酵母膏：0.5克；胰蛋白腖：1克；酚紅：0.18克；無機鹽基礎：10毫升，pH7.8的磷酸緩衝液：1000毫升。
結果顯示：乾酪乳桿菌N1115可以很好地利用核糖、半乳糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、D-塔格糖、.D-松二糖、松三糖、N-乙醯-葡糖胺、葡萄糖酸鹽作為碳源，套用柳醇、纖維二糖、蔗糖、攏牛兒糖的能力較弱，不能利用甘油、赤蘚糖、D-阿拉伯糖、.L-阿拉伯糖等。具體檢測結果如表2所示。
表2.乾酪乳桿菌N1115的Api50鑑定結果
註：“+”表示發酵；“－”表示不發酵。
三、基因特徵
該實施例所提供的乾酪乳桿菌N1115菌株，套用PCR對其16SrDNA測序，結果如下：
套用PCR對其延長因子Tuf基因進行測序，結果如下：
根據該實施例乾酪乳桿菌N1115的上述16SrDNA序列和延長因子Tuf基因序列，可以確定：乾酪乳桿菌N1115是一株新穎的乾酪乳桿菌菌株。
- 實施例 三急性毒理學試驗
該實施例所提供的菌株N1115經急性毒性試驗（GB15193.3—2003）檢測無毒副作用，其中小鼠急性經口毒性試驗結果如表3所示。實驗採用的試驗樣品按所需劑量用牛奶配置，其中菌株N1115的濃度為7.0×10細菌群落總數每毫升；所用小鼠為河北省動物中心提供的清潔級昆明小鼠（試驗動物許可證好：KM1107023）20隻，體重18-22克，雌雄各半。
實驗方法採用一次最大限量法，選用昆明種小鼠20隻，劑量為10000毫克/千克體重。動物實驗前禁食過夜。染毒後，觀察小鼠的一般情況，中毒症狀和死亡情況，觀察期限14天。根據試驗結果計算LD50，並確定急性毒性分級。
結果顯示，染毒後，動物無不良反應、中毒表現和死亡情況出現。觀察期滿，處死所有動物，並進行解剖，經肉眼觀察未發現異常的組織或臟器。雄性動物：LD50＞10000毫克/千克體重；雌性動物：LD50＞10000毫克/千克體重。按急性毒性分級LD50＞10000毫克/千克體重，該受試物屬於無毒物。
表3.乾酪乳桿菌N1115（7.0×10細菌群落總數每毫升）小鼠急性經口毒性試驗
- 實施例四 菌株的抗藥性特徵
該實施例對乾酪乳桿菌N1115進行了耐藥性試驗（試驗結果參考表4）乾酪乳桿菌N1115耐藥性檢測：採用“抗生素類藥敏紙片”（杭州天和微生物試劑有限公司）紙片方法，通過檢測抑菌圈的大小檢測菌株對抗生素的抗藥性。
結果顯示：乾酪乳桿菌N1115對青黴素類、β-內醯胺/β-內醯胺酶抑制劑複合物、頭孢類、單環內醯胺類、等27種抗生素的檢測結果均為陰性，表明乾酪乳桿菌N1115對該27中抗生素沒有抗藥性。
表4.乾酪乳桿菌N1115耐藥性檢測
- 實施例五 乾酪乳桿菌N1115耐酸耐膽鹽特性
該實施例對所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115進行了耐酸耐膽鹽實驗。挑取1接種環菌株接種到MRS培養基中，培養35℃、72小時，取出計數；同時，各取1毫升該發酵液，分別加入pH2.0磷酸鹽緩衝液中（37℃孵育2小時），和3‰的豬膽鹽溶液（35℃孵育6小時），取出後，立即進行梯度稀釋（0.85%滅菌生理鹽水），進行菌落培養計數，計算其存活率。
乾酪乳桿菌N1115耐受酸和膽鹽的特性參考表5。結果顯示，乾酪乳桿菌N1115具有同時耐酸和耐膽鹽的特性，酸液處理後的存活率為22.92‰，膽鹽溶液處理後的存活率為0.83‰。
表5.乾酪乳桿菌N1115耐受酸和膽鹽的特性
- 實施例六 乾酪乳桿菌N1115的API20結果
該實施例對所提供的菌株乾酪乳桿菌N1115進行了酶活性研究。通過生物梅里埃公司（ApIbioMerieuxltd.）的半定量ApIZym試紙條，共檢測了19種酶的活性，分別是：Alkakinphosphatase（鹼性磷酸酶）、Esterase（酯酶）、Esteraselipase（酯酶脂酶）、Lipase（脂肪酶）、Leucinearylamidase（亮氨酸氨基肽酶）、Valinearylamidase（纈氨酸芳基醯胺酶）、Cystinearylamidase（胱氨酸芳基醯胺酶）、Trypsin（胰蛋白酶）、Chymotrypsin（糜凝乳蛋白酶）、Acidphosphatase（酸性磷酸酯酶）、Phosphoamidase（磷醯化酶）、ɑ-Galactosidase（ɑ-半乳糖苷酶）、ß-Galactosidase（ß-半乳糖苷酶）ß-Glucuronidase（ß-葡糖醛酸糖苷酶）ɑ-Glucosidase（ɑ-（葡萄）糖苷酶）、ß-Glucosidase（ß-（葡萄）糖苷酶）、N-acetyl-β-glucosaminidase（N-乙醯-β-葡萄糖苷酶）、ɑ-Mnnosidase（α-甘露糖苷酶）、ɑ-Fucosidase（ɑ-岩藻糖苷酶）。
乾酪乳桿菌N1115在瓊脂MRS培養基斜面上35℃培養72小時；用液體MRS培養基將其沖洗下來，調節乾酪乳桿菌N1115濃度為10細菌群落總數每毫升，得菌懸液；根據操作手冊，取65µl乾酪乳桿菌N1115菌懸液分別加入到試劑孔中，所有試劑條放置到35℃條件孵育24小時；接著加入API試劑ZyM1和ZyM2，然後，通過試劑盒廠家提供的比色表，進行酶活性的讀數（樣品中酶的濃度以納摩爾來表示），結果如表6所示。
表6.乾酪乳桿菌N1115的酶活性測定
由表6可見，乾酪乳桿菌N1115具有較高的Leucinearylamidase（亮氨酸氨基肽酶）、Valinearylamidase（纈氨酸芳基醯胺酶）、ɑ-Glucosidase（ɑ-（葡萄）糖苷酶）活性，其次為Esterase（酯酶）、Esteraselipase（酯酶脂酶）ß-Galactosidase（ß-半乳糖苷酶）、Acidphosphatase（酸性磷酸酯酶）的活性。
- 實施例七 乾酪乳桿菌N1115刺激產生IL-12、IL-6、TNF-a的能力
該實施例所提供乾酪乳桿菌N1115可以同時刺激小鼠巨噬細胞株（J774.1）產生IL-12、IL-6、TNF-a。乾酪乳桿菌N1115首先在MRS培養基中培養，35℃，培養72小時；然後將其用磷酸鹽緩衝液（pH7.1）洗脫下來，離心清洗2-3次。最後將離心下來的N1115懸浮於RPMI1640培養基（Sigma公司，StLouis，MO，美國）中，菌懸液濃度為10細菌群落總數每毫升。
細胞株J744.1分別加入到24孔圓底的細胞培養板中，使每孔中的細胞濃度為5×105細胞/2毫升；在每孔中添加100µl滅活的乾酪乳桿菌N1115菌懸液，放置到37℃，5%CO2的二氧化碳培養箱，孵育4小時；收集上層液體，放置於-70℃的冰櫃中用於分析。L-12、IL-6、TNF-a濃度（單位為匹克/毫升）的檢測套用商業ELISA檢測試劑盒來進行，檢測結果參考圖1—圖3。
- 實施例八 具有免疫調節作用、含乾酪乳桿菌N1115菌株的酸牛奶的製備
其製備方法如下：
將鮮牛奶加熱到50-60℃，加入白砂糖（與牛奶的重體積比為6%~8%，單位克/毫升），攪拌至完全溶解，預熱至60℃左右，20兆帕壓力下均質，95℃殺菌5分鐘，冷卻至35℃~40℃，接種乾酪乳桿菌N1115，接種量1×10細菌群落總數每毫升以上。35℃~40℃發酵（發酵的同時加攪拌），至pH值為4.0~4.5即得含有活性乾酪乳桿菌N1115的優酪乳（存放條件：需於4℃冷藏）。
- 實施例九 具有免疫調節作用、含乾酪乳桿菌N1115菌株乳酸菌飲料的製備
取實施例八製備好的優酪乳，用製備好的稀釋液稀釋2-3倍，混合均勻，即可製成可直接飲用的乳酸菌飲料，4℃保存。
稀釋液製備方法如下：95℃熱水895克，加入糖漿100克，CMC（羧甲基纖維素鈉）：5克，攪拌混勻，在90℃以上的條件下，保持20分鐘，然後將溫至40℃，即可作為可使用的稀釋液。
- 實施例十 具有免疫調節作用、含乾酪乳桿菌N1115菌株製劑的製備方法
乾酪乳桿菌N1115首先在MRS培養基中培養，35℃，培養48小時~72小時；取發酵液1000毫升，用冷凍離心機離心（溫度：4℃，離心時間：10分鐘，離心力：3000克），獲得濃縮的乾酪乳桿菌N1115發酵液，然後將其冷凍至-40℃~-60℃放置24小時，經冷凍乾燥機乾燥，至含水量為3%~5%，壓碎成粉末狀；將上述粉末加入到奶粉、豆粉等產品中製成粉末狀或片、塊狀產品。
此外，根據該實施例，該乳酸菌可添加到人們常用的藥物組合物、營養補充品、食品、保健食品、醫療食品或其組分中。
榮譽表彰
2018年12月20日，《乾酪乳桿菌N1115、其免疫調節作用及套用》獲得第二十屆中國專利優秀獎。
