乳酸菌製劑檢驗法，屬於細菌界，本試驗法包括牛奶凝固力、乳酸鑑別法、活乳酸菌數測定法及其鑑別法。
基本介紹
- 中文學名：乳酸菌製劑
- 界：細菌界
簡介,說明,
簡介
【通用名稱】乳酸菌製劑檢驗法
拼音名：
英文名：
書頁號：S1-·62
標準編號：WS1-F03-89
拼音名：
英文名：
書頁號：S1-·62
標準編號：WS1-F03-89
本試驗法包括牛奶凝固力、乳酸鑑別法、活乳酸菌數測定法及其鑑別法。
說明
一、牛奶凝固力及乳酸鑑別法
1.牛奶培養基的製備 取新鮮牛奶，用蒸汽加熱20分鐘或置沸水浴中煮30分鐘後，於冷處放置18小時以上，使乳脂析出，然後用虹吸管吸出脫脂溶液，分裝試管中，每管20ml，用115.5℃蒸汽滅菌20分鐘。
2.試驗法 (1)牛奶凝固力 取供試品0.1～0.3g，加至牛奶培養基20ml中，搖勻，在37℃培養48小時，同時作兩管，作為供試品管，以牛奶培養基為對照管，供試品管的牛奶應呈正常凝固現象（表面無多量乳清分出，凝塊均勻稠密結實，無氣體產生，無消化現象）。
(2)乳酸鑑別 取上述供試品管和對照管的培養液各1ml，分別注入兩支試管 (15×160mm)中，各加10%硫酸3～5滴，振搖，加乙醚約10ml，猛烈振搖，放置數分鐘，分別將上層乙醚液倒入兩支試管(16×180mm)中，於熱水浴中，除去乙醚。殘留物中各加水2ml，搖勻，分別吸取0.2ml置另兩支試管中，各加硫酸2ml，搖勻，置水浴中加熱2分鐘,取出,立刻用冷水冷卻，分別滴入10%愈創木酚的乙醇溶液1滴,振搖後,對照管顯橙色。
供試品管應顯紅色。
(2)乳酸鑑別 取上述供試品管和對照管的培養液各1ml，分別注入兩支試管 (15×160mm)中，各加10%硫酸3～5滴，振搖，加乙醚約10ml，猛烈振搖，放置數分鐘，分別將上層乙醚液倒入兩支試管(16×180mm)中，於熱水浴中，除去乙醚。殘留物中各加水2ml，搖勻，分別吸取0.2ml置另兩支試管中，各加硫酸2ml，搖勻，置水浴中加熱2分鐘,取出,立刻用冷水冷卻，分別滴入10%愈創木酚的乙醇溶液1滴,振搖後,對照管顯橙色。
供試品管應顯紅色。
3.結果的判斷 (1)乳酸鑑別試驗呈正反應，牛奶呈正常凝固現象，供試品優良。
(2)乳酸鑑別試驗呈正反應，牛奶呈不均勻的粉碎的凝塊，並分出大量乳清,凝塊有氣泡及消化現象，表示有雜菌生長，供試品合格。
(3)乳酸鑑別試驗呈負反應，牛奶呈不正常凝固或者不凝固，供試品不合格。
(2)乳酸鑑別試驗呈正反應，牛奶呈不均勻的粉碎的凝塊，並分出大量乳清,凝塊有氣泡及消化現象，表示有雜菌生長，供試品合格。
(3)乳酸鑑別試驗呈負反應，牛奶呈不正常凝固或者不凝固，供試品不合格。
二、活乳酸菌數測定法
1.培養基的製備 (1)含糖牛肉湯培養基
牛肉浸液 1，000ml
氯化鈉 5g
腖 10g
乳糖 20g
取氯化鈉、腖、乳糖加入牛肉浸液中，置水浴上加溫，攪拌，使完全溶解，放冷至室溫，調節pH值使滅菌後為6.0，115.5℃滅菌20分鐘。
(2)含糖牛肉湯瓊脂培養基 照含糖牛肉湯培養基的處方，加瓊脂使每100ml中含瓊脂1.5～2g，在水浴上加熱使溶解，分裝後，115.5℃滅菌20分鐘。
(3)20%碳酸鈣混懸液 取極細結晶性的碳酸鈣粉末,加水製成20%的混懸液,121.5℃滅菌20分鐘。
牛肉浸液 1，000ml
氯化鈉 5g
腖 10g
乳糖 20g
取氯化鈉、腖、乳糖加入牛肉浸液中，置水浴上加溫，攪拌，使完全溶解，放冷至室溫，調節pH值使滅菌後為6.0，115.5℃滅菌20分鐘。
(2)含糖牛肉湯瓊脂培養基 照含糖牛肉湯培養基的處方，加瓊脂使每100ml中含瓊脂1.5～2g，在水浴上加熱使溶解，分裝後，115.5℃滅菌20分鐘。
(3)20%碳酸鈣混懸液 取極細結晶性的碳酸鈣粉末,加水製成20%的混懸液,121.5℃滅菌20分鐘。
2.測定法 (1)供試品稀釋液的製備 按無菌操作法，從兩個包裝供試品中，取樣10g,加入滅菌生理鹽水100ml，振搖均勻，製成混懸液，用1ml的滅菌吸管稀釋製成1：100,1：1,000，1：10,000，1：100,000，1：1,000,000等各種稀釋度的混懸液,每一稀釋度吹洗三次，並更換吸管。
(2)接種與培養 用滅菌吸管吸取每種稀釋度的混懸液1ml，吹入滅菌平皿中,每份同法接種二個平皿。
將20%碳酸鈣混懸液置水浴中加溫後，搖勻,趁熱用滅菌吸管吸取5ml加至已溶化的含糖牛肉湯瓊脂培養基100ml中,搖勻，放冷至45～55℃，取10～15ml加至上述已接種供試品稀釋液的平皿中，隨即轉動平皿，使充分混合均勻，待瓊脂凝固後，翻轉平板，在37℃培養72小時後，觀察結果。有透明圈的菌落即為乳酸菌。
(3)菌落計算 選取菌落分布均勻、菌落數為30～300個的平皿，點數菌落的數目。
求得兩個平皿的平均菌落數(若兩個平皿的菌落數相差一倍以上，需重新試驗)，再乘以供試品的稀釋倍數，即為每1g乳酸菌製劑所含活菌數。
(2)接種與培養 用滅菌吸管吸取每種稀釋度的混懸液1ml，吹入滅菌平皿中,每份同法接種二個平皿。
將20%碳酸鈣混懸液置水浴中加溫後，搖勻,趁熱用滅菌吸管吸取5ml加至已溶化的含糖牛肉湯瓊脂培養基100ml中,搖勻，放冷至45～55℃，取10～15ml加至上述已接種供試品稀釋液的平皿中，隨即轉動平皿，使充分混合均勻，待瓊脂凝固後，翻轉平板，在37℃培養72小時後，觀察結果。有透明圈的菌落即為乳酸菌。
(3)菌落計算 選取菌落分布均勻、菌落數為30～300個的平皿，點數菌落的數目。
求得兩個平皿的平均菌落數(若兩個平皿的菌落數相差一倍以上，需重新試驗)，再乘以供試品的稀釋倍數，即為每1g乳酸菌製劑所含活菌數。
三、乳酸菌鑑別法
1.運動性檢查 (1)培養基 用活乳酸菌測定法項下含糖牛肉湯培養基。
(2)鑑別法 自活乳酸菌計數的平皿中，選出具有透明圈的各種不同形態的菌落,每種選取兩個菌落，分別種入含糖牛肉湯培養基中，在37℃培養24小時後，應生長發育良好，取菌液，以懸滴檢查法觀察，應無運動性。
1.運動性檢查 (1)培養基 用活乳酸菌測定法項下含糖牛肉湯培養基。
(2)鑑別法 自活乳酸菌計數的平皿中，選出具有透明圈的各種不同形態的菌落,每種選取兩個菌落，分別種入含糖牛肉湯培養基中，在37℃培養24小時後，應生長發育良好，取菌液，以懸滴檢查法觀察，應無運動性。
2.石蕊牛奶凝固試驗 (1)石蕊牛奶培養基的製備 取牛奶培養基,每100ml中加入石蕊乙醇溶液2.5ml，混勻，取5～10ml分裝於試管中，管115.5℃滅菌20分鐘。
(2)試驗法 自上項含糖牛肉湯培養液中，取一白金耳菌液，種入5～10ml的石蕊牛奶培養基中，在37℃培養48小時，石蕊應還原為無色，牛奶應呈正常凝固現象，培養基上層表面應呈紫紅色環。
(2)試驗法 自上項含糖牛肉湯培養液中，取一白金耳菌液，種入5～10ml的石蕊牛奶培養基中，在37℃培養48小時，石蕊應還原為無色，牛奶應呈正常凝固現象，培養基上層表面應呈紫紅色環。
3.顯微鏡檢查 自上項含糖牛肉湯培養液中取菌液塗片，革蘭氏染色後，於油鏡下檢查，記錄其形態和革蘭氏染色的顏色。
4.酸度測定及乳酸鑑別試驗 自上項含糖牛肉湯培養液中取一白金耳菌液，種入牛奶培養基20ml中，另取對照用牛奶培養基20ml，同時在37℃培養48小時後，分別進行酸度測定及乳酸鑑別試驗。
5.接觸酶試驗 自上項含糖牛肉湯培養液中取一白金耳菌液，種於含糖牛肉湯瓊脂斜面上，在37℃培養48小時後，將3%過氧化氫溶液滴加於生長的菌落表面上,觀察有無氣泡產生，有氣泡則為陽性反應，反之則為陰性反應。
新鮮牛奶 取比重在1.028以上的牛奶5ml與水20ml，置50～100ml的錐形瓶中,加酚酞指示液3滴,用氫氧化鈉液(0.1mol/L)滴定至顯示的淡紅色在1分鐘內不完全消失為止。一般新鮮牛奶所消耗的氫氧化鈉液(0.1mol/L)不得超過1.0ml。
乳酸菌的酸度測定 照上法測定。
牛肉浸液 取新鮮牛肉，除去肌腱及脂肪，切細，絞碎後，每1,000g加水3,000ml,充分拌勻，在2～10℃浸泡20～24小時後，煮沸1小時，濾過，壓乾肉渣，補足液量，分裝，121℃滅菌30分鐘，置冷暗處備用。也可用牛肉浸膏3g，加水1,000ml，配成溶液代替。
活乳酸菌計數 如果在較小稀釋度培養基中所生長的菌落數量較多,菌落形態相似,呈極小點狀或梭狀，或在較大稀釋度培養基中菌落形態相似時，可能為乳酸菌生長，照乳酸菌鑑別法項下的懸滴檢查法或石蕊牛奶凝固試驗法鑑別，如為乳酸球菌，應不計算在內。
石蕊乙醇溶液 取石蕊20g，研磨後置錐形瓶中，加入40%乙醇150ml，煮沸1分鐘,倒出上層液，再加入40%乙醇150ml，煮沸1分鐘，倒出上層液，與第一次倒出液合併。
再以40%乙醇加至全量為300ml.滴加鹽酸液(1mol/L),隨加隨振搖,至溶液變紫色為止。pH值應為6.0～8.0。
再以40%乙醇加至全量為300ml.滴加鹽酸液(1mol/L),隨加隨振搖,至溶液變紫色為止。pH值應為6.0～8.0。
