中藥當歸中靶向於群感機制的抗耐藥菌活性物質研究

《中藥當歸中靶向於群感機制的抗耐藥菌活性物質研究》是依託廣東工業大學，由鄭俊霞擔任負責人，於2012年批准的國家自然科學基金青年科學基金項目。

該項目綜合套用多種柱色譜方法從當歸中分離並鑑定60個化合物。運用生物膜抑制活性模型，評價分離得到的單體化合物活性；首次發現苯酞類、多烯脂肪酸類化合物具有較強的生物膜抑制活性，同時發現聚炔類、酚酸類等類型化合物亦具有生物膜抑制活性。且發現丁烯基苯肽、(E)-6,7–二羥基藁苯內酯、(3Z)7-羥基-3-亞丁基苯酞、11-當歸醯基-Z-11-羥基藁本內酯這四個化合物能在不抑制銅綠假單胞菌生長的情況下，顯著抑制綠膿菌素和鼠李糖脂等毒力因子的濃度。研究活性化合物與QS相關基因的關係，發現苯酞類、聚炔類、多烯脂肪酸類化合物能夠阻止LuxR蛋白介導的群體感應抑制，並能在較低濃度下降低lasB啟動子對gfp（ASV）的融合，其中falcarindiol等聚炔類化合物對LasR基因的表達具有較強的抑制作用。發現活性化合物主要通過氫鍵和疏水作用與lasR受體蛋白相作用，研究苯酞類化合物QS抑制作用的構效關係。整合各類別活性成分的作用機制，明確中藥當歸通過其中含有的苯酞類、聚炔類、脂肪酸、酚酸類等化學成分協同作用達到抗耐藥菌的結果，其中苯酞類、聚炔類、多烯脂肪酸化合物可以做為群體感應抑制劑的先導化合物進行進一步的研究。通過該項目的研究，闡明傳統中藥當歸抗耐藥菌作用的藥效物質和作用機制，發現3類具有群體感應抑制的先導化合物。

基本介紹

• 中文名：中藥當歸中靶向於群感機制的抗耐藥菌活性物質研究
• 批准號：81202889
• 依託單位：廣東工業大學
• 負責人：鄭俊霞
• 項目類別：青年科學基金項目
• 批准年度：2012年
• 資助經費：23（萬元）
• 研究期限：2013年1月1日至2015年12月31日
• 申請代碼：H3203

項目性質

項目背景

抗生素耐藥性是全球嚴重的公共衛生問題，亟待解決。群體感應（QS）是細菌產生耐藥性的重要機制之一。

項目定位

該課題組通過對臨床上抗菌有效方劑組方中藥進行分析，找出當歸等一批高頻出現的中藥。基於QS系統的lasR受體及AHL分子對這些中藥已報導的兩千多種化學成分進行虛擬篩選，並結合提取物的生物膜抑制活性實驗結果，確定當歸具有較好的QS抑制活性。該項目擬在前期工作基礎上，開展有效中藥當歸QS抑制活性物質研究：系統分離、鑑定當歸中的化學成分；運用生物膜抑制活性模型，評價單體化合物活性；使用QSIS篩選體系，研究活性化合物與QS相關基因關係；利用活性單體化合物與lasR受體對接，進一步驗證和解釋其作用機制；套用3D-QSAR模組，研究化合物構效關係，尋找先導化合物。該項目擬綜合套用傳統醫藥學和現代科學，闡明傳統中藥當歸抗耐藥菌作用的科學內涵，為解決抗生素耐藥性提供一條新途徑，具有重要意義和潛在的套用價值。

項目分工

該項目是由廣東工業大學與廣州中醫藥大學共同合作完成。廣東工業大學主要完成當歸中化學成分的系統分離和化合物結構的鑑定以及單體化合物的生物膜抑制活性工作，廣州中醫藥大學主要完成化合物虛擬篩選、活性化合物QS抑制作用機制研究以及構效關係研究工作。雙方共同努力，發揮各自優勢，促成項目按照既定計畫進度順利完成，並共同發表文章及申請專利。

項目各研究成員分工

成員	單位	項目分工
鄭俊霞	廣東工業大學	項目主持，化學成分系統分離
郅慧	廣州中醫藥大學	虛擬篩選、構效關係
王華倩	廣東工業大學	生物膜抑制活性
盧海嘯	廣州中醫藥大學	QS抑制作用機制研究
張磊	廣東工業大學	化合物分離及結構鑑定
吳盼盼	廣東工業大學	化合物分離及結構鑑定
周曉宏	廣州中醫藥大學	QS抑制作用機制研究

研究成果

1．當歸中化學成分的系統分離及化合物的結構鑑定

當歸（Angelica sinensis）藥材10kg，用10倍量95%的乙醇提取3次，每次2h，合併提取液，乙醇提取液減至無醇味，混懸於20L水中，依次用等體積石油醚（60℃~90℃）、醋酸乙酯、正丁醇萃取3次。得石油醚萃取物240g、醋酸乙酯萃取物90g、正丁醇萃取物350g和水層640g.綜合利用矽膠、sephadex LH-20ODS柱色譜以及反相製備型高效液相色譜法等方法對石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取物進行了分離純化，得到60個化合物。並利用MS、NMR確定了它們的平面結構，部分化合物的絕對構型化合物的立體結構採用X-ray、Mosher以及ECD等方法進行確定。這60個包括苯酞類、二聚苯酞類、聚炔類、酚酸類、脂肪酸、香豆素類、黃酮類等在內的各類型化合物。其中化合物3-丁基-4,5,6,7-四氫-6-羥基-7-甲氧基苯酞（3-butyl-4,5,6,7-tetrahydro-6-hydroxy-7-methoxy-phthalide）、panaxydiol、1-亞油酸甘油酯（（9Z,12Z）9,12-Octadecadienoic acid- 2,3-dihydroxypropyl ester）；7-經基-8-異戊烯基香豆素（7-Hydroxy-8-prenyl-coumarin）為首次從該植物中分離得到。

2．單體化合物生物膜抑制活性評價

運用生物膜抑制活性模型，評價了分離得到的單體化合物活性；首次發現苯酞類化合物具有較強的生物膜抑制活性，它們包括：丁烯基苯肽、（E）-6,7-二羥基藁苯內酯、（3Z）7-羥基-3-亞丁基苯酞、11-當歸醯基-Z-11-羥基藁本內酯、（Z）-5-羥基-3-丁烯基苯酞、（Z）-6,7-二羥基藁苯內酯、（3S）-4-羥基-3-正丁基苯酞、新蛇床內酯、（3Z）5-經基-3-亞丁基苯酞、（3S）-3-丁基-4-羥基苯肽、（3S）-3-丁基-5-羥基苯肽；首次發現多烯脂肪酸類化合物：亞油酸、1-亞油酸甘油酯等具有較強的生物膜抑制活性，同時亦發現聚炔類化合物falcarindiol、酚酸類化合物阿魏酸、香草醛等亦具有生物膜抑制活性。

3、苯酞類化合物對銅綠假單胞菌生長抑制及毒力因子的抑制活性評價

完成了對具有較強生物膜抑制活性的苯酞類化合物：丁烯基苯肽、（E）-6,7一二羥基藁苯內酯（E2B）、（3Z）7-羥基-3-亞丁基苯酞（E3D2）、11-當歸醯基-Z-11-羥基藁本內酯（E3F）對銅綠假單胞菌的生長抑制及兩種毒力因子綠膿菌素和鼠李糖脂的抑制活性評價。結果顯示這四種化合物均能在不抑制銅綠假單胞菌生長的情況下，顯著抑制綠膿菌素和鼠李糖脂等毒力因子的濃度。

4、使用QSIS篩選體系，研究活性化合物與QS相關基因的關係

苯酞類、聚炔類、多烯脂肪酸類化合物能夠阻止LuxR蛋白介導的群體感應抑制（QS），並能在較低濃度下降低lasB啟動子對gfp（ASV）的融合。

5、利用計算化學方法，完成活性化合物與lasR受體相關蛋白的對接，並解釋其作用機制；套用3D-QSAR模組，研究化合物構效關係

（1）中藥當歸中具有QS抑制的活性化合物主要通過氫鍵和疏水作用與lasR受體蛋白相作用。

為研究活性化合物與lasR受體蛋白作用機制，選取評分最高的配體8-hydroxy-1-methoxy-，Z-9-heptadecene-4,6-diyn-3-one進行結合分析。8-hydroxy-1-methoxy-，Z-9-heptadecene-4,6-diyn-3-one的不飽和聚炔鍵和烯鍵伸入到活性口袋內部的疏水區，而且分子的空間延伸方向合理；8-hydroxy-1-methoxy-，Z-9-heptadecene-4,6-diyn-3-one的-OH羰基與lasR活性位點上的一個胺基酸殘基形成氫鍵作用，結合能較低,使結合作用更穩定。

（2）套用3D-QSAR模組，研究了苯酞類化合物QS制活性的構效關係。

苯酞類化合物QS抑制活性的構效關係如下：

（I）苯酞母核中苯環的氫化程度對化合物QS抑制活性有較大影響：

四氫苯酞類化合物>二氫苯酞類化合物>苯酞類化合物

（II）苯酞母核中苯環上羥基取代對化合物QS抑制活性有較大影響，經基取代越多，QS抑制活性越強：

苯環上鄰位二羥基取代>苯環上單羥基取代>苯環上無羥基取代

（III）苯酞母核中側鏈上正丁烯基酯化後抑制作用更強

6、通過對各類別活性成分作用機制的整合分析，揭示當歸抗耐藥菌作用的科學內涵

中藥當歸抗耐藥菌的機制是通過其中含有的苯酞類、聚炔類、酚酸類、脂肪酸類等化學成分協同作用。這些類型的化合物均能夠阻止LuxR蛋白介導的群體感應抑制作用，其中聚炔類、苯酞類化合物對LaR基因的表達具有較強的抑制作用，脂肪酸、酚酸類化合物對LaR基因的表達具有較一定的抑制作用。苯酞類、多烯脂肪酸類化合物對銅綠假單胞菌生物膜具有較強的抑制作用,且苯酞類化合物能在不抑制銅綠假單胞菌生長的情況下,顯著抑制綠膿菌素和鼠李糖脂等毒力因子的濃度。綜合各項實驗結果，可以明確苯酞類、聚炔類、多烯脂肪酸化合物可以做為群體感應抑制劑的先導化合物進行進一步的研究。

標題	類型	作者
Two new steroidal saponins from Selaginella uncinata （Desv.） Spring and their protective effect against anoxia	期刊論文	Fan, Ming,Fang, Yanxiong,Zhao, Suqing,Zhang, Kun
Insight into the Interactions between Novel Isoquinolin-1,3-Dione Derivatives and Cyclin-Dependent Kinase 4 Combining QSAR and Molecular Docking	期刊論文	Yiqun Chang,Mengjia Yang，GaoKeng Xiao，PingHua Sun
γ-Lactone Derivatives and Terpenoids from Selaginella uncinata and Their Protective Effect Against Anoxia	期刊論文	Zhiyun Du,Kun Zhang,Liying Wu,Ming Fan
Two new steroidal saponins from selaginella uncinata （Desv.） spring and their protective effect against anoxia	期刊論文	SMing Fan,Yanxiong Fang,Suqing Zhao,Kun Zhang
Insight into the Interactions between Novel Isoquinolin-1,3-Dione Derivatives and Cyclin-Dependent Kinase 4 Combining QSAR and Molecular Docking	期刊論文	Chang, Yiqun,Yang, Mengjia,Xiao, Gaokeng,Sun, Pinghua

人才培養

1、鄭俊霞於2015年入選“廣東省高校優秀青年教師培養計畫”培養對象、廣州市“珠江科技新星”計畫；

2、鄭俊霞於2014年入選廣東省高等學校“千百十人才培養工程”第八批校級培養對象。

合作交流

人員合作

2013年3月至2013年8月，項目負責人在moffitt cancer cennter進行為期五個月的短期交流合作。學習虛擬篩選，群體感應抑制生物活性測試方面的內容，為項目的如期完成奠定了基礎。

學術交流

• 學術會議

時間	會議名稱	會議地點
2014年11月21-23日	2014年全國天然藥物有機化學	廣州
2015年8月23日-26日	2015年全國藥物化學學術會議暨第五屆中英藥物化學學術會議（CMCS2015 & China-UK JSMC-5）	蘭州

項目資金

國家自然科學基金項目資金決算表（定額補助）

金額單位：萬元
科目名稱	預算數			累計支出數	結餘
	批准預算	預算調整數	調整後預算
	（1）	（2）	（3）=（1）+（2）	（4）	（5）=（3）-（4）
合計	23.0000	0.0000	23.0000	20.7840	2.2160
1、設備費	4.8000	0.0000	4.8000	4.8000	0.0000
（1）設備購置費	4.8000	0.0000	4.8000	4.8000	0.0000
（2）設備試製費	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000
（3）設備升級改造與租賃費	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000
2、材料費	5.6500	1.4130	7.0630	6.8880	0.1750
3、測試化驗加工費	2.0000	2.7654	4.7654	4.7654	0.0000
4、燃料動力費	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000
5、差旅費	1.5000	-0.2964	1.2036	0.8626	0.3410
6、會議費	1.5000	-1.0000	0.5000	0.0000	0.0000
7、國際合作與交流費	2.0000	-2.0000	0.0000	0.0000	0.0000
8、出版/文獻/信息傳播/智慧財產權事務費	1.0000	-0.8820	0.1180	0.1180	0.0000
9、勞務費	3.4000	0.0000	3.4000	2.2000	1.2000
10、專家諮詢費	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000
11、其他支出	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000	0.0000
12、管理費（2014年及以前批准項目）	1.1500	0.0000	1.1500	1.1500	0.0000
註：該表中（1）（3）（5）欄為項目系統自動生成，不需項目負責人填寫；2.該表中（2）欄填列經批准的預算調整數；3.該表中（4）欄填列項目的實際支出數。

項目成員

鄭俊霞，女，博士，教授，碩士研究生導師；主要從事中藥及天然藥物化學相關的教學科研工作。

王華倩，女，副教授，碩士生導師，廣東工業大學優秀青年教師培養對象，優秀青年授課教師。美國新澤西州立羅格斯大學蘇珊萊曼克萊曼腫瘤研究中心博士後。

張磊，廣東工業大學輕工化工學院黨支部副書記、高級實驗師。