《三疣梭子蟹蛻皮抑制激素基因表達及生理功能的研究》是朱冬發為項目負責人，寧波大學為依託單位的面上項目。
基本介紹
- 中文名：三疣梭子蟹蛻皮抑制激素基因表達及生理功能的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：朱冬發
- 依託單位：寧波大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
三疣梭子蟹是我國海水人工增養殖的主要種類之一。在已經對三疣梭子蟹蛻皮抑制激素（MIH）全長cDNA進行分子克隆和序列分析、採用大腸桿菌表達系統獲得MIH重組蛋白和製備重組MIH（rMIH）多克隆抗體的基礎上，本項目擬進一步通過RT-PCR和定量PCR技術分析三疣梭子蟹MIH基因的組織特異性表達、在蛻皮周期中的表達水平變化和在卵巢發育過程中的表達水平變化；通過免疫細胞化學方法定位合成MIH的眼柄神經分泌細胞；建立蛻皮類固醇分離、定量檢測方法，通過離體培養和活體注射相結合的生物活性分析實驗探討rMIH對三疣梭子蟹蛻皮和卵巢發育的調控作用。開展三疣梭子蟹MIH基因表達和生理功能的研究，將有助於闡明MIH在三疣梭子蟹蛻皮和卵巢發育過程中的分子調控機制，豐富甲殼動物神經內分泌學理論；將為解決三疣梭子蟹人工增養殖中所遇到的蛻皮未遂、性早熟和卵巢發育不良等難題提供理論指導。
結題摘要
套用基因組步移技術克隆了三疣梭子蟹蛻皮抑制激素（MIH）基因組全長序列。三疣梭子蟹MIH基因的的表達具有組織特異性，在眼柄X器-竇腺複合體（XO-SG）中表達最強。對重組MIH（rMIH）進行了純化、復性和質譜鑑定，理論推導的胺基酸序列（ABZ04547）有兩條肽段與重組MIH蛋白完全匹配，序列分別為-VEWICDDCANIYR- 和–DCFFNEDFLWCVR-。rMIH分子量為12660.2617Da，具有4個二硫鍵。依據形態學變化將三疣梭子蟹蛻皮周期劃分為蛻皮後期、蛻皮間期、蛻皮前期和蛻皮期。根據甲殼硬度變化將蛻皮後期細分成A期和B期；根據游泳足趾節末端新舊錶皮基線間距/舊錶皮厚度的比值並結合解剖後新殼的生長狀況，蛻皮前期被細分為D0亞期、D1亞期、D2亞期、D3亞期和D4亞期。建立了利用HPLC-QqQ MS測定三疣梭子蟹血淋巴20-羥基蛻皮酮濃度的方法，檢出限為0.03 μg/L。採用實時螢光定量PCR（qRT-PCR）分析了眼柄XO-SG中MIH基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達水平變化。結果表明：從D0亞期至D4亞期，MIH基因表達量逐漸降低；蛻皮後MIH基因表達量再逐漸升高到蛻皮間期達到頂峰。在蛻皮周期中，血淋巴20-羥基蛻皮酮濃度與MIH基因表達量呈現拮抗性，揭示MIH通過抑制Y器合成蛻皮激素而調控三疣梭子蟹蛻皮過程。通過活體注射和離體培養相結合的生物活性分析實驗探討了rMIH對三疣梭子蟹蛻皮的調控作用。結果表明：活體注射rMIH能降低血淋巴20-羥基蛻皮酮濃度；活體注射rMIH和XO-SG提取物相比注射蟹生理鹽水能顯著延長蛻皮周期；Y器分泌蛻皮酮的水平隨著離體培養液中rMIH濃度的增加而下降。因此，rMIH具有抑制三疣梭子蟹蛻皮的生物學活性。採用qRT-PCR技術分析了三疣梭子蟹二次卵巢發育過程中眼柄XO-SG中MIH基因和卵巢、肝胰腺中Vg基因的表達水平變化。結果表明，卵巢和肝胰腺中Vg基因的表達水平與卵巢發育正相關，眼柄XO-SG中MIH基因的表達水平與卵巢發育負相關。rMIH能抑制卵巢和肝胰腺離體組織塊Vg基因的表達，進一步表明MIH能抑制三疣梭子蟹卵巢發育。這些研究成果不僅在豐富甲殼動物神經內分泌學理論方面具有重要的理論意義，而且能為解決三疣梭子蟹人工增養殖中所遇到的蛻皮未遂和卵巢發育不良等難題提供理論指導。
