《一種類人膠原蛋白及其生產方法》是范代娣於2001年2月21日申請的發明專利，該專利的申請號為011067578，公布號為CN1371919，授權公布日為2002年10月2日，發明人是范代娣。
《一種類人膠原蛋白及其生產方法》公開一種類膠原蛋白及通過基因工程菌生產類膠原蛋白的方法。其類人膠原蛋白的生產方法包括：類人膠原蛋白的工程菌的構建；將工程菌的發酵培養；再經類人膠原蛋白的誘導及表達，提純，獲得目的蛋白。該方法獲得的重組蛋白在單細胞內的表達高，其類膠原蛋白為螺旋結構，異於動物體原蛋白的交叉結構，因此它具有很好的可加工性而不改變其分子量，因此類人膠原蛋白可加工成手術縫合線、人工皮膚、膠片余層，人工器官塗層等，也可與鹵化銀、染料等結合形成具有優良表面粘性的塗料。
2016年12月7日，《一種類人膠原蛋白及其生產方法》獲得第十八屆中國專利金獎。
基本介紹
- 中文名：一種類人膠原蛋白及其生產方法
- 公布號：CN1371919
- 授權日：2002年10月2日
- 申請號：011067578
- 申請日：2001年2月21日
- 申請人：范代娣
- 地址：陝西省西安市西北大學化工系
- 發明人：范代娣
- Int.Cl.：C07K14/78；C12P21/02
- 代理機構：西安新思維專利事務所有限公司
- 代理人：李罡
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
膠原蛋白是人體固有蛋白之一，它在皮膚里的含量最多，由於膠原蛋白固有的生物兼容性、生物降解性和吸收性、促新細胞形成及促上皮細胞形成功能，膠原蛋白在醫學領域、美容、化妝品、保健品行業的潛在用途不斷拓寬，但是，動物體膠原蛋白是一種硬蛋白（水不溶），並且隨著年齡的增長，內部雙鍵越來越多，同時也越來越硬。一般，經酶解獲得的膠原蛋白為水不溶性蛋白，也不可能在不改變分子量情況下重溶解。因此，可加工性能很弱，直接限制了許多潛在用途的開發。另外，來自動物體的膠原蛋白不可能排除病毒隱患，同時始終帶有牛膠原的特性，為了降低其免疫排異反應，科學家們曾想法從人胎盤中獲取膠原蛋白，但是，該研究受到世界人權組織及FDA的阻力，因為，不能確切檢測每個胎盤組織的病毒和細菌。
在2001年2月前技術中，中國國內外市場小批量膠原蛋白的生產均來自動物皮、跟腱、軟骨和人胎盤的提取物。其提取工藝分三步，一、溶解；二、酶處理；三、純化。但通過動物皮提取類膠原蛋白可能帶有各種病毒，因此動物皮及臟器提取物的各種產品直接用於人體會造成嚴重隱患。
中國國外報導用重組技術生產膠原蛋白研究有：重組酵母細胞生產準人膠原蛋白II，重組哺乳動物細胞生產準人膠原蛋白I，II，III型，重組啤酒酵母細胞生產準人膠原蛋白VI，重組昆蟲細胞生產準人膠原蛋白II，表達量為50毫克/毫升，人腫瘤細胞生產準人纖維膠原1A1和1A2，由於動物細胞培養成本昂貴，周期長，一般15天甚至更長，另外培養規模只能限於實驗規模，要滿足產業化、大批量需求幾乎是完全不可能。另外，這些重組類膠原蛋白都必須有後轉化酶的參與，必須有一個後轉化工藝，截至2001年2月，用重組動物細胞生產膠原蛋白必須8種後轉化酶的參與，轉化工藝相當複雜。
發明內容
專利目的
《一種類人膠原蛋白及其生產方法》目的是提供一種能在單細胞內取得高表達的類人膠原蛋白，其具有優於動物體膠原蛋白的獨特的化學結構和性能，同時提供該膠類人原蛋白的生產方法。
技術方案
一種類人膠原蛋白，其特殊之處在於：其序列如下：
HDP VVL QRR DWE NPG VTQ LNR HLA HAH PPF ASD HPM GAP GPA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GAL GAH GPA GPL GPA GPP GSA GAP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAP GAT GLS AGA THG LVT CGL，其結構為三鏈、三螺旋結構，其核酸長度為1071bp。
一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在於：它包括以下步驟：
1）類人膠原蛋白的工程菌的構建；
2）工程菌的發酵培養；
3）類人膠原蛋白的誘導及表達；
4）類人膠原蛋白的提純。
一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在於：所述類人膠原蛋白的工程菌的構建如下：
1）將人體已知膠原蛋白序列的一段基因抽提出來並進行修飾後，再特定重複，然後進行縫合，DNA重組；
2）將重組DNA轉入到大腸桿菌；
一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在於：所述工程菌的發酵培養基為：酵母粉10-30克/升、葡萄糖15-38克/升、NaHPO42.5-8.7克/升、（NH4）2SO43.6-5.6克/升、FeCl30.8-1.6克/升、CoCl2.6H2O0.1-0.3克/升、ZnSO40.1-0.3克/升。
一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在於：所述工程菌的發酵培養條件為：培養溫度34℃，pH7.0溶氧DO20％，空氣流量為1VVM-4VVM，攪拌轉速450轉/分-1000轉/分，接種量5％，種子培養基，LB培養基、卡那黴素0.5毫克/升、葡萄糖5克/升，以葡萄糖濃度控制1.5％為宜，用DO量控制為40％為宜，當OD600的值為150時收穫細胞。
一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在於：所述類人膠原蛋白的提純如下：細胞經離心收集後經高壓細胞勻將，然後用緩衝液抽提，經過第一次甲酸緩衝液鹽析後，接著進行離子交換，再經金屬離子螯合吸附，精製和除熱源，精品去冷凍乾燥。
技術領域
《一種類人膠原蛋白及其生產方法》涉及一種類人膠原蛋白及通過基因工程菌生產類人膠原蛋白的方法。
權利要求
1、一種類人膠原蛋白，其特徵在於：其序列如下：
HDP VVL QRR DWE NPG VTQ LNR HLA HAH PPF ASD HPM GAP GPA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GAL GAH GPA GPL GPA GPP GSA GAP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAP GAT GLS AGA THG LVT CGL，所述結構為三鏈、三螺旋結構，其核酸長度為1071bp。
2、根據權利要求1所述的類人膠原蛋白的生產方法，其特徵在於：
1）類人膠原蛋白的工程菌的構建；
2）工程菌的發酵培養；
3）類人膠原蛋白的誘導及表達；
4）類人膠原蛋白的提純。
3、根據權利要求2所述的類人膠原蛋白的生產方法，其特徵在於：所述類人膠原蛋白的工程菌的構建如下：
1）將人體已知膠原蛋白序列的一段基因抽提出來並進行修飾後，再特定重複，然後進行連線，DNA重組；
2）將重組DNA轉入到大腸桿菌。
4、根據權利要求2所述的類人膠原蛋白的生產方法，其特徵在於：所述工程菌的發酵培養基為：
產品 | 用量 | 產品 | 用量 |
酵母粉 | 10-30克/升 | 葡萄糖 | 15-38克/升 |
NaHPO4 | 2.5~8.7克/升 | （NH4）2SO4 | 3.6-5.6克/升 |
FeCl3 | 0.8-1.6克/升 | CoCL2.6H2O | 0.1-0.3克/升 |
ZnSO4 | 0.1-0.3克/升 | / | / |
5、根據權利蓼求2所述的類人膠原蛋白的生產方法，其特徵在於：所述工程菌的發酵培養條件為：培養溫度34°C，pH7.0WD020%，空氣流量為1WM-4VVM，攪拌轉速450轉/分-1000轉/分，接種量5%，種子培養基，LB培養基、卡那黴素0.5毫克/升、葡萄糖5克/升，以葡萄糖濃度控制1.5%為宜，用DO。量控制為40%為宜，當OD600的值為100時收穫細胞。
6、根據權利要求2所述的類人膠原蛋白的生產方法，其特徵在於所述類人膠原蛋白的提純如下：細胞經離心收集後經高壓細胞勻漿，然後用緩衝液抽提，經過第一次甲酸或乙酸緩衝液鹽析後，接著進行離子樹脂交換，再經金屬離子螯合吸附，精製和除熱源，精品去冷凍乾燥。
實施方式
類人膠原蛋白的生產方法包括：類人膠原蛋白的工程菌的構建；工程菌的發酵培養和誘導；膠原蛋白的提純，獲得目的蛋白。
- 一、類人膠原蛋白的工程菌的構建
（一）從E.coLi菌株製備質粒DNA：
在小規模製備時：質粒DNA從1.5毫升大腸桿菌培養物經酸溶解法製備。
在大規模製備時：載體菌株在含有抗菌素的培養基上培養過夜，離心收集細胞、離心速度10000轉/分5分鐘，然後重新懸浮於10毫升冰冷的TE緩衝液溶液（10毫升EDTA，pH8，）再離心，再懸浮於4毫升TES（TE及20％的蔗糖液中），加入溶解酶培養5分鐘後加入2毫升0.5摩爾/升EDTA，培養10分鐘後加入蛋白溶解酶及溶解緩衝液，後經培養、離心收集（35000轉/分收集2小時）後上清液轉入離心管按比例加入CsCl等。
（二）DNA醇析
在DNA樣品中加入10％的醋酸鈉（pH7.5）及3倍體積的冷乙醇，-70℃培養30分鐘，此時DNA析出。4℃離心5分鐘後將上清液重新醇析（用80％的冷乙醇），之後重新溶入DNA緩衝液中。
（三）DNA限制性內切酶消化
將DNA用限制性內切酶在其相應的緩衝液中用酶消化，DNA濃度維持4％，37℃培養3小時，緩衝液配比（0.37摩爾/升Tris，0.74摩爾/升醋酸鉀），0.2摩爾/升乙酸鎂0.05摩爾/升DTT（二硫蘇糖醇），pH＝8.0。
（四）DNA電泳分析
於DNA樣品中加入電泳緩衝液，50V恆壓下運行20小時。緩衝液配比同常規電泳緩衝液。
- 實施例1：D1型膠原蛋白
用限制性內切酶HindIII合成PPD1121質粒進行消化，然後用瓊脂糖分離，取膠原蛋白基因片段，純化後與消化後的質粒PSC101縫合，縫合DNA轉入大腸桿菌BL21或HB101中，用卡納黴素進行克隆選擇。將克隆株重新培養，用SDS-Page進行抗性識別和蛋白表達分析。
（五）DNA連線
在DNA縫合粘合劑作用下於室溫下反應2小時。對鈍端反應劑為每微克DNA加入MgCl25毫摩爾/微克、Tris-HCl20-25毫摩爾/微克、DTT5-10毫摩爾/微克、BSA180-220毫克/微克、ATP0.5-0.75毫摩爾和400-450單位。T4 DNA連結酶，縫合反應室溫下1小時-2小時。
（六）DNA瓊脂糖連線
將瓊脂糖溶解（65℃），降至37℃時，加入縫合緩衝液，室溫縫合1小時。
（七）DNA純化及瓊脂糖DNA純化
分別依據Millipore ultrafree-probind filter Unit處理，或用Bio-Spin 6 Column柱處理。
（八）轉細菌方法
1、E.coli細胞的製備
接種大腸桿菌細胞BL21於無菌LB培養基中34℃振盪培養，當OD600為0.5時，置於冰浴中10分鐘，然後離心分離（6000轉/分下10分鐘），細胞收集物重新懸浮於0.1摩爾/升MgCl2溶液中冰浴40分鐘中，離心收集，於細胞收集物中加入冰浴過的100毫摩爾/升CaCl22毫升，無菌條件下，冰浴培養24小時，細胞被分到小離心管內-70℃保存。
2、E.coli轉化
將細胞解凍並冰浴，每50微升細胞加1微克DNA，冰浴30分鐘，然後42℃水浴2分鐘，加入1毫升LB培養基，將混合物轉入34℃振盪培養2小時。此時10％的轉化物含有抗菌素。
（九）蛋白表達分析
在搖瓶內裝入10％LB培養液加入5％的卡那黴素於34℃培養過夜，當OD600達1時，將溫度調至42℃培養2小時後冰浴，以備免疫印標實驗用。
（十）免疫印跡實驗
依據蛋白電泳實驗程式，將凝膠一維電泳轉化到二維凝膠電泳，然後經過牛奶培養，用小鼠抗體IgG及磷酸絲氨酸抗體PSR-45進行免疫印跡實驗。
（十一）胺基酸含量分析
使用胺基酸分析儀，樣品經6N HCL水解。
（十二）DNA序列分析
使用DNA序列分析儀。
（十三）胺基酸序列分析
使用胺基酸序列分析儀。
- 二、工程菌的發酵培養和誘導
發酵條件
培養溫度34℃，pH7.0溶氧DO20％，空氣流量為1VVM-4VVM，攪拌轉速450轉/分-1000轉/分，接種量5％，種子培養基，LB培養基、卡那黴素0.5毫克/升、葡萄糖5克/升。
流加策略：以葡萄糖濃度控制1.5％為宜，用DO量控制為40％為宜。
當OD600的值為100時將培養溫度調節到42℃誘導2小時收穫細胞。
發酵培養基為：酵母粉10-30克/升、葡萄糖15-38克/升、NaHPO42.5-8.7克/升、（NH4）2SO43.6-5.6克/升、FeCl30.8-1.6克/升、CoCl2.6H2o0.1-0.2克/升、ZnSO40.1-0.3克/升。
發酵培養基的最佳方案為：酵母粉20克/升、葡萄糖30克/升、NaHPO46.7克/升、（NH4）2SO45.6克/升、微量元素FeCl31.2克/升、CoCl2.6H2O0.2克/升、ZnSO40.2克/升。
補料培養基：10倍濃縮的發酵培養基。
- 三、類人膠原蛋白的提純
分離純化工藝
離心收集→細胞勻漿→緩衝液抽提→鹽析→離子交換→柱層析精製→冷凍乾燥。
細胞經離心後加入緩衝液（Tis pH8.0，10毫摩爾/升EDTA）按5倍於細胞濕重加緩衝液體積。超聲破碎20分鐘後，用甲酸緩衝液鹽析粗提後，用離子交換樹脂吸附以0.5摩爾/升NaCl、20毫摩爾/升Tris pH8.0洗脫後，再用金離螯合柱吸附、洗脫，收集蛋白冷凍乾燥。
《一種類人膠原蛋白及其生產方法》將人體已知序列的膠原蛋白的一段基因經修飾後進行特定重複而後克隆到大腸桿菌中，籍細胞的快速繁殖在特定條件下通過誘導獲得的，並經過對其水溶性、免疫排異性、穩定性、成膠性、吸收性等特性的改進，使其產品結構及性能在中國國內、外屬首創。該發明取得了膠原蛋白的高表達，其表達量為20-50％，其生成的類人膠原蛋白脯氨酸較動物體膠原蛋白少40％-60％，這給該發明生產的類人膠原蛋白增添了很多動物體膠原蛋白不具備的優勢，其化學活性胺基酸部位更多，其衍生物種類將更加多樣化，其性能將更能滿足不同行業的需求。
該技術所產生的類人膠原蛋白不但具有動物體膠原蛋白固有的生物兼容性及生物重吸收性，而且在特定溫度下具有熱可逆成膠的特性；具有低免疫排異反應和無病毒隱患的優點，它可以實現高分子膠原蛋白在單細胞內的高表達；它產生的類人膠原蛋白為螺旋結構，具有優於動物體膠原蛋白的獨特的化學結構和性能，如熱可逆成膠性，水溶性，低免疫排異反應等，例如，為了降低生物體膠原蛋白的免疫排異反應，使用的三肽鏈含有帶有簡單側鏈的甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸等並進行獨特的序列重複，這種重複序列來自生物體已知膠原蛋白序列的結構中的一部分，改進了生物體膠原蛋白的——GXY結構（這裡的X，Y可以是任何胺基酸）。動物體膠原蛋白由於旋轉、定型等不可能在不減少分子量條件下重溶解，因此類人膠原蛋白便可加工成手術縫合線人工皮膚、膠片塗層，人工器官塗層等，也可與鹵化銀、染料等結合形成具有優良表面粘性的塗料。
榮譽表彰
2016年12月7日，《一種類人膠原蛋白及其生產方法》獲得第十八屆中國專利金獎。
