《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》是浙江海正藥業股份有限公司於2011年5月21日申請的專利，該專利的申請號為2011101431773，公布號為CN102363755A，授權公布日為2012年2月29日，發明人是陳華、葉美麗、鄭玲輝、王玲萍、白驊。
《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》公開了一種新的鏈黴菌，通過培養它製備阿黴素或其類似物的方法。該發明的鏈黴菌Streptomyces sp.H323（CGMCC4827）是一種全新的菌種，其在含有可同化碳源和氮源的營養培養基中，並在通氧的條件下通過發酵可生產阿黴素或其類似物。
2016年12月7日，《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法
- 公布號：CN102363755A
- 授權日：2012年2月29日
- 申請號：2011101431773
- 申請日：2011年5月21日
- 申請人：浙江海正藥業股份有限公司
- 地址：浙江省台州市椒江區外沙路46號
- 發明人：陳華、葉美麗、鄭玲輝、王玲萍、白驊
- Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I；C12P19/56(2006.01)I；C12R1/465(2006.01)N
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
蒽環類抗生素（如阿黴素、柔紅黴素、表阿黴素）是抗腫瘤藥物。阿黴素和柔紅黴素的結構基本相同（差異只在一個羥基上，如下式I），柔紅黴素只對急性白血病（leukemia）有效，而阿黴素對惡性腫瘤的治療範圍則很寬。
/ | R1 | R2 | R3 |
柔紅黴素 | C（O）CH3 | H | OH |
阿黴素 | C（O）CH2OH | H | OH |
表阿黴素 | C（O）CH3OH | OH | H |
1974年，美國專利US3,803,124公開了阿黴素可由發酵產物柔紅黴素通過化學半合成而製得。2011年5月前，通過柔紅黴素半合成是工業化生產阿黴素的方法。義大利的法瑪西雅厄普約翰公司在中國專利CN1147835A中公開了一種由柔紅黴素通過酶法轉化製備阿黴素的方法。此外，美國專利US3,590,028公開了一株阿黴素產生菌種Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCCNo.27952。美國專利US4,012,284公開了另外一株阿黴素產生菌種Streptomyces peucetius ATCCNo.29050。
2011年5月前技術中雖然有報導阿黴素產生菌種，但還停留在實驗室階段，未形成產業化。因此，尋找能夠產生阿黴素的新微生物菌種和新的製備方法的工作仍在繼續進行中。
發明內容
專利目的
《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》的目的之一在於提供一種新的能產生阿黴素或其類似物的微生物菌種，一種新的鏈黴菌H323，其保藏編號為CGMCC4827。
《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》還提供新的鏈黴菌H323（CGMCC4827）（Streptomyces sp.H323），其可以套用於生產阿黴素或其類似物，或者套用於產生含有阿黴素的藥物組合物。
《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》還提供了一種採用鏈黴菌H323（CGMCC4827）製備阿黴素或其類似物的方法。
技術方案
《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》包括採用鏈黴菌H323（CGMCC4827）在含有可同化的碳、氮源的營養培養基里，進行有氧發酵的過程。
上述可同化的碳源選自澱粉、糊精、葡萄糖、工業糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物質的組合。
上述可同化的氮源選自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白腖、蛋白腖、黃豆餅粉、棉籽餅粉、花生餅粉、麩質粉、玉米漿乾粉、麩皮、尿素、銨鹽之一或上述物質的組合。
所述發酵培養的溫度為20℃-40℃，優選25℃-30℃，pH為6.5-7.5之間，優選6.8左右；培養時間為144-216小時；通氧量為0.5-1.0vvm。
所述發酵方式為液體深層發酵。
阿黴素可通過以下方法進行檢測：色譜柱為C18柱，5微米，4.6×250毫米；流動相：緩衝液:乙腈:甲醇＝500:500:60；緩衝液：取十二烷基硫酸鈉1.44克和磷酸0.68毫升溶於500毫升超純水中；流速：1.35毫升/分鐘；檢測波長：254mn；進樣量：10微升。
《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》中所採用的阿黴素產生菌種還可以為鏈黴菌H323（CGMCC4827）、鏈黴菌H323（CGMCC4827）自發的突變株或通過常規的誘變得到的突變株，優選阿黴素產生菌為鏈黴菌H323（CGMCC4827）。
鏈黴菌H323（Streptomyces sp.）（CGMCC4827）的微生物菌種於2011年5月4日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
（地址：北京市朝陽區北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所），保藏號為CGMCC4827，並登記入冊，證明存活。
上述菌株主要生物學特徵為：菌落顏色桔黃色偏紅，菌落形態較圓整，表面有褶皺突起，直徑大小為中型（約6毫米左右），無孢子，基內菌絲髮達，菌絲與培養基結合緊密，不易挑起。
《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》描述了Streptomyces sp.H323的形態學和分子水平上的特徵，經過和已知的阿黴素產生菌進行形態學和分子水平的比較，可以認定Streptomyces sp.H323屬於鏈黴菌屬，但它不同於已知的阿黴素產生菌Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCCNo.27952，Streptomyces peucetius ATCCNo.29050，而是一種全新的菌種。
改善效果
《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》與原工藝相比具有以下優點：
1.簡化生產工藝。該發明所述菌種能夠通過直接發酵方法生產阿黴素或其類似物，省去了從柔紅黴素經化學合成得到阿黴素的工藝，有利於降低生產成本和減少環境污染。
2.提高發酵單位。該發明所述菌種產生阿黴素或其類似物的產量較原始菌種有了大幅度的提高，有利於實現工業化生產。
附圖說明
圖1為《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》菌株的菌落形態；a：ISP2培養基添加微量元素；b：ISP3培養基；c：ISP4培養基；d：ISP2培養基。
圖2為該發明的菌株的菌絲形態；a：×400倍菌絲形態；b：×1000倍菌絲形態。
圖3為該發明的菌株在搖瓶中的發酵過程曲線（-■-：阿黴素產量；-▽-總糖；-△-：還原糖；-□-：pH值）；
圖4為該發明菌株產生的阿黴素的HPLC圖譜；
圖5為該發明菌株產生的阿黴素的ESI/MS分析圖譜；
圖6為該發明菌株產生的阿黴素的H-NMR圖譜；
圖7為該發明菌株產生的阿黴素的C-NMR圖譜。
技術領域
《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》涉及一種新的鏈黴菌，通過發酵培養該菌產生阿黴素或其類似物的方法。
權利要求
1.一種鏈黴菌H323，具有產生阿黴素或其類似物的能力。
2.根據權利要求1所述的鏈黴菌H323，其特徵在於其保藏編號為CGMCC4827。
3.根據權利要求2所述的鏈黴菌H323（CGMCC4827），在製備阿黴素或其類似物中的套用。
4.一種發酵生產阿黴素或其類似物的方法，其特徵在於：包括採用鏈黴菌H323在含有可同化的碳源和氮源的營養培養基里，進行有氧發酵的步驟。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於：所述可同化的氮源選自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白腖、蛋白腖、黃豆餅粉、棉籽餅粉、花生餅粉、麩質粉、玉米漿乾粉、麩皮、尿素、銨鹽之一或上述物質的組合。
7.根據權利要求4～6任何一項所述的製備方法，其特徵在於：其中所採用的阿黴素產生菌為鏈黴菌H323（CGMCC4827）、鏈黴菌H323（CGMCC4827）自發的突變株或通過常 規的誘變得到的突變株。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於：其中所採用的阿黴素產生菌為鏈黴菌H323（CGMCC4827）。
9.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於：所述發酵培養的溫度為20℃-40℃，pH為6.5-7.5之間，培養時間為144-216小時。
實施方式
實施例1：菌株來源
稱取NTG晶體10毫克，溶解在10毫升無菌Tris緩衝液（pH8.0）中，再用移液管加入1毫升菌懸液，置於28℃培養基中旋轉式或往復式搖床上振盪處理30分鐘。將處理過的菌懸液經適當稀釋塗布於ISP2平板上。未作誘變處理的菌懸液亦經適當稀釋塗布於ISP2平板作為對照。28℃培養10天后，檢查菌落數，並計致死率。
挑選經過NTG誘變後的單菌落1000株，進行搖瓶發酵，HPLC檢測阿黴素產量。結果篩選出最高產突變菌株Streptomycessp.H323。
實施例2：菌種鑑定
該菌株主要生物學特徵為：菌落顏色桔黃色偏紅，菌落形態較圓整，表面有褶皺突起，直徑大小為中型（約6毫米左右），無孢子，基內菌絲髮達，菌絲與培養基結合緊密，不易挑起。具體菌落形態和菌絲形態如圖1和圖2所示。
根據放線菌16SrRNA保守序列設計下列引物，並由上海生工生物工程公司合成：
上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
下游引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’
利用上述引物對該菌株的16SrDNA序列進行PCR擴增，PCR體系為：
ddw | 14.25微升 |
10×PCR Buffer | 2.0微升 |
dNTP mixture | 0.5微升 |
Taq聚合酶 | 0.25微升 |
引物l（16f） | 1.0微升 |
引物2（16R2） | 1.0微升 |
DNA模板 | 1.0微升（根據濃度定量） |
PCR循環條件：95℃預變性5分鐘，循環參數95℃變性1分鐘，52℃復性45s，72℃延伸1.5分鐘，重複35個循環後，72℃再延伸10分鐘，最後4℃保溫。用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。選用條帶清晰的產物進行純化。
擴增產物經凝膠電泳回收，並連線到T載體後進行測序，獲得了該菌株16SrDNA一級結構的序列。通過在Genebank資料庫中進行相似性搜尋（blast），結果發現其與波塞鏈黴菌變種Streptomyces peucetiussub sp.caesius ATCCNo.27952的16SrDNA序列同源性為96％。與另一株波塞鏈黴菌Streptomyces peucetius ATCCNo.29050的16SrDNA序列同源性為97％。
綜上所述，H323屬於鏈黴菌屬，但它不同於已知的阿黴素產生菌Streptomyces peucetiussub sp.caesiusATCCNo.27952和Streptomyces peucetius ATCCNo.29050。Streptomyces sp.H323是一株全新的菌種。
實施例3：製備阿黴素
（1）斜面菌絲體的製備與培養
斜面孢子培養基配方（克/升）：酵母抽提物4，麥芽抽提物10，葡萄糖4，瓊脂20，消前pH6.5-6.8，試管30×200毫米，裝量20毫升，經121℃滅菌20分鐘後，冷卻到50-60℃擺斜面，接入一環菌絲體經28±1℃培養10天后，菌絲成熟。
（2）種子液的製備與培養
種子培養基配方（克/升）：可溶性澱粉30，葡萄糖10，黃豆餅粉20，CaCO32，NaCl3，消前pH6.5，搖瓶裝液量為250毫升三角瓶裝25毫升，經121℃滅菌20分鐘。菌體接種量為10-10菌落數/毫升，培養溫度28±1℃，250轉每分，搖床振盪培養48小時，這時培養液pH7.0-7.5，菌絲濃度為15-20％（體積百分比）。
（3）阿黴素發酵培養基的製備與培養
發酵培養基配方（克/升）：玉米澱粉80，酵母粉30，CaCO33，NaCl3，消前pH6.8，搖瓶裝液量為250毫升三角瓶裝25毫升，經121℃滅菌20分鐘。將種子液以5-10％（體積百分比）的接種量接入，在28±1℃，250轉每分搖床振盪培養7天，發酵結束後HPLC測阿黴素單位，測得單位為200毫克/升。
實施例4：製備阿黴素
（1）種子罐種子液的製備
在20升種子罐中投入15升的種子培養基（種子培養基的配比見實施例3，同時添加0.3％的豆油作消泡劑），滅菌採用蒸汽滅菌，121℃條件下30分鐘，待冷卻後，接入200毫升搖瓶種子液，培養溫度28±1℃，攪拌轉速200轉每分，通氣量1vvm，培養48小時，此時pH7.0-7.5，菌絲濃度為15-25％。
（2）發酵罐培養基的配製與培養
發酵培養基的配方與前述實施例3相同，但要添加0.05％PPG作為消泡劑，發酵罐50升，投料體積為35升，消前pH6.8，消後pH7.0，於121℃下蒸汽滅菌30分鐘，冷卻後，接入約3.5升種子罐培養液，發酵溫度28±1℃，攪拌槳轉速150-200轉每分，通氣量為0.8-1.0vvm，發酵培養7天，放罐，測得阿黴素發酵單位為300毫克/升。
實施例5：製備阿黴素
種子培養基（克/升）：葡萄糖20，可溶性澱粉20，酵母粉10，酵母抽提物5，玉米漿粉5，黃豆餅粉10，CaCO34，MgSO4·7H2O1，NaCl3，pH6.5，搖瓶裝液量為30毫升/250毫升三角瓶，經121℃滅菌30分鐘。從實施例3的斜面挖一塊菌絲體接入種子培養基，置於搖床上28℃培養45小時。然後2.5毫升的種子培養液接入發酵培養基（克/升）：麥芽糊精100，黃豆餅粉30，麩質粉2.5，NaCl2，CaCO33，FeSO4·7H2O0.001，MnCl2·4H2O0.003，CoCl2·6H2O0.01，ZnSO4·7H2O0.005，pH6.8。發酵培養基裝量為25毫升/250毫升三角瓶，121℃滅菌30分鐘，置於搖床上28℃培養7天。HPLC檢測，發酵單位為280毫克/升。
實施例6：製備阿黴素
種子培養液的製備按照實施例5進行。然後2.5毫升的種子培養液接入發酵培養基（克/升）：澱粉100，酵母粉30，黃豆餅粉3，NaCl2，CaCO33，FeSO4·7H2O0.001，MnCl2·4H2O0.003，ZnSO4·7H2O0.005，pH6.8。發酵培養基裝量為25毫升/250毫升三角瓶，121℃滅菌30分鐘，置於搖床上28℃培養7天。HPLC檢測，發酵單位為300毫克/升。
實施例7：製備阿黴素類似物
種子培養液和發酵培養基的製備及培養按照實施例3進行。發酵結束後HPLC測阿黴素類似物單位，其中柔紅黴素為60毫克/升，雙氫柔紅黴素為20毫克/升。
榮譽表彰
2016年12月7日，《一種鏈黴菌及其生產阿黴素的方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
