一種赤黴菌及發酵生產赤黴素GA4+7的方法:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案

《一種赤黴菌及發酵生產赤黴素GA4+7的方法》是南京工業大學於2012年11月19日申請的專利，該專利的公布號為CN102978122A，申請公布日為2013年3月20日，發明人是胡永紅、李佼佼、楊文革、錢永根、唐容容。該發明屬於發酵工程領域。

《一種赤黴菌及發酵生產赤黴素GA4+7的方法》所述方法包括：平板培養，種子培養，發酵培養以及在發酵培養過程中的條件控制，在發酵培養基中添加混合碳源，在特定的發酵時間補加植物油、添加特徵性前體及增加氧通量，而達到提高GA₄₊₇效價的目的。本菌株發酵獲得的GA₄₊₇效價高，成本低，操作簡便，有利於工業化生產。

2017年12月11日，《一種赤黴菌及發酵生產赤黴素GA4+7的方法》獲得第十九屆中國專利優秀獎。

基本介紹

中文名：一種赤黴菌及發酵生產赤黴素GA4+7的方法
申請人：南京工業大學
申請日：2012年11月19日
申請號：2012104702697
公布日：2013年3月20日
公布號：CN102978122A
發明人：胡永紅、李佼佼、楊文革、錢永根、唐容容
地址：江蘇省南京市鼓樓區新模範馬路5號
分類號：C12N1/14(2006.01)I、C12P27/00(2006.01)I、C12R1/645(2006.01)N
代理機構：南京天華專利代理有限責任公司
代理人：徐冬濤、袁正英
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

中國是擁有幾千年歷史的農耕大國，在傳統的種植業中糧食的產量在很大程度上取決於當地的日照、溫度、濕度等氣候條件。利用現代科學技術，突破環境地域的限制，是解決糧食危機的主要手段。研究發現，植物細胞在接受溫度光照等環境信號時，會產生低濃度可調節植物生理反應的活性物質，影響細胞的分裂、伸長、分化，這些活性物質被稱為植物激素。赤黴素是六大植物激素之一，2012年前已發現上百種赤黴素同系物，GA₄₊₇和GA₃最具使用價值和商業價值。GA₃因為活性過高，副作用很大，GA₄₊₇以其獨特的優勢成為了2012年前農業領域研究的熱點。它在植物體內的含量非常低，工業中主要是通過赤黴菌發酵生產，作為一種新型高效的植物生長激素，主要具有如下特點：①破壞休眠。植物在開花前都需要經過低溫和長日照，以促進GA₄₊₇的合成，打破植物的休眠，外源性的添加GA₄₊₇可以使植物種子提前發芽。②增加座果，植物的開花期用GA₄₊₇噴灑後可以防止空洞果，增加座果率，能防止在使用其它的生長激素過程中所帶來的營養的浪費。③刺激細胞分裂擴大，GA₄₊₇可以抑制細胞壁過氧化物酶的活性，增加壁的柔韌性，而具有更好伸展性，生長加快，能使細胞周期縮短30%左右。④誘導單性結實，如在諸如葡萄、草莓、杏、梨、番茄等果實的生長前期，用一定濃度的GA₄₊₇噴灑，可生長得到無籽果實。

GA₄₊₇是不能人工合成的植物激素，其工業化生產主要是利用赤黴菌發酵生產。赤黴菌發酵會產生不同種類的赤黴素，其中以GA₃為主，對以產GA₄₊₇為主的菌種報導極少。GA₄₊₇作為赤黴菌的次級代謝產物，培養條件與營養組分對其產量影響很大。不同的碳源、氮源、pH及溫度均會對其產生影響，再加上赤黴菌是強好氧菌，對氧氣的需求量非常高，不同的發酵條件會產生不同種類赤黴素，對後期分離提取提出了很高的要求。這嚴重製約著GA₄₊₇的產量，針對這些問題，若能利用GA₄₊₇產生菌建立一套最佳化的發酵方法，增加GA₄₊₇效價，將具有巨大的套用前景。

發明內容

專利目的

《一種赤黴菌及發酵生產赤黴素GA4+7的方法》的目的是提供一種赤黴菌；該發明的另一目的提供一種利用上述赤黴菌發酵生產赤黴素GA₄₊₇的方法，在於通過發酵培養基的最佳化及發酵條件的控制提高GA₄₊₇產量。

技術方案

《一種赤黴菌及發酵生產赤黴素GA4+7的方法》的技術方案為：一種赤黴菌，菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號是CGMCCNo.5588，分類命名赤黴菌，菌種的拉丁學名Gibberellafujikuroi，參據的微生物株NJYHWG32261，保藏日期是2011.12.14。

該發明還提供了一種利用上述赤黴菌發酵生產GA₄₊₇的方法，其具體步驟為為：

（1）平板培養：將赤黴菌NJYHWG32261菌種接到PDA培養基上，在pH6.0～7.0，溫度為26～32℃，培養2～4天，得到活化的赤黴菌菌落；其中PDA培養基的組成為（克/升）：土豆汁150～250、葡萄糖10～30、瓊脂15～20；

（2）種子培養：從PDA培養基上挑1-2個活化的赤黴菌菌落到裝種子培養基的搖瓶中，在pH6.0～7.0，溫度為26～32℃，搖床轉速為160～200轉每分，培養2～4天，得到種子液；其中種子培養基的裝液量為搖瓶體積的10～20%；種子培養基為（克/升）：葡萄糖30～50、NH₄NO₃1～2、MgSO₄·7H₂O0.8～1.2、KH₂PO₄·3H₂O0.5～1.0；

（3）發酵培養：將種子液按發酵培養基體積的5%～10%比例接種於裝發酵培養基的搖瓶中，控制pH6.0～7.0，溫度為26～32℃，搖床轉速為160～200轉每分，在發酵過程的前期增大發酵液的通氣量，發酵中後期補加植物油和特徵前體，培養6～8天，得到發酵液；其中發酵培養基的裝液量為搖瓶體積的10～20%；發酵培養基為（克/升）：30～50的速效碳源與10～30的遲緩碳源、0.5～1.0的氮源、MgSO₄·7H₂O0.8～1.2、KH₂PO₄·3H₂O0.5～1.0、NaCl3～5；

優選步驟（3）所述的速效碳源為葡萄糖、蔗糖、飴糖或乳糖；遲緩碳源為糊精或澱粉水解液；氮源為（NH₄）₂SO₄、NH₄NO₃、NaNO₃、花生餅粉、黃豆餅粉或玉米漿。優選步驟（3）中發酵24～28小時把搖床轉速提高到220～230轉每分以提高發酵液的通氣量；在發酵72～120小時補加植物油，植物油的加入質量與發酵培養基裝液量體積比為0.1～0.3克/升；特徵前體的加入質量與發酵培養基裝液量體積比為0.2～0.4克/升；所述的植物油為豆油或芝麻油；所述的特徵前體為氨基乙酸或甲羥戊酸。

CGMCCNo.5588菌株具有下述性質：

1、形態與培養特徵：

在PDA培養基上培養，菌落圓形，菌絲為白色，稠密的細絨毛狀，生長旺盛，後期中央菌絲由白色轉為黑灰色。有性世代產生子囊孢子，子囊殼呈橢球狀，黑色，大小為10~25.5×10.2~19.6微米。無性世代產生分生孢子，白色，孢子鐮刀型，有隔膜。赤黴菌菌絲生長和子囊孢子萌發都要合適條件：最適溫度28℃，相對濕度70%，喜偏酸性近中性，pH6.0~7.0，最適pH6.8。

2、生理生化特性：

赤黴菌CGMCCNo.5588菌株的主要生理生化特徵見表1：

表1菌株的生理生化特徵

性質	描述	性質	描述
蔗糖	＋	氯化銨	＋
D-果糖	＋	磷酸二氫銨	＋
葡萄糖	＋	L-組氨酸	＋
木糖	－	L-胱氨酸	－
木糖醇	－	脲	＋
乳糖	＋	甘氨酸	＋
山梨糖	－	DL-丙氨酸	＋
澱粉	＋	蜜二糖	＋
D-半乳糖	＋	纖維二糖	＋
L-阿拉伯糖	－	麥芽糖	＋
甘露醇	＋	赤蘚糖醇	－
pH	4.5~9.0	溫度	8~37℃
最適pH	6.6~6.8	最適溫度	26~28℃

註：＋：陽性或生長；－：陰性或不生長

有益效果

（1）篩選到一株以積累GA₄₊₇為主的赤黴菌，菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號是CGMCCNo.5588。

（2）根據次級代謝產物的發酵特點，我們在初始培養基中添加速效及遲緩混合碳源，並根據該菌株的特性，在發酵對數期增加通氣量。達到的菌體生產與產物積累的平衡點。

（3）在發酵穩定前期，即GA₄₊₇大量合成前期，補加植物油及特徵性前體，使得GA₄₊₇的積累量更高。HPLC檢測發酵液中提取的GA混合物發現至少含有70%的GA₄₊₇，GA₄:GA₇為（3±0.5）:1。

保藏信息

上述赤黴菌GibberellafujikuroiCGMCCNo.5588是由本實驗室選育並保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），其簡稱為CGMCC，登記入冊的編號是CGMCCNo.5588，保藏日期是：2011.12.14。

權利要求

1.一種赤黴菌，菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號是CGMCCNo.5588，分類命名赤黴菌，菌種的拉丁學名Gibberellafujikuroi，參據的微生物株NJYHWG32261，保藏日期是2011.12.14。

2.一種利用如權利要求1所述赤黴菌發酵生產赤黴素GA₄₊₇的方法，其具體步驟為：

3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：步驟（3）所述的速效碳源為葡萄糖、蔗糖、飴糖或乳糖；遲緩碳源為糊精或澱粉水解液；氮源為（NH₄）₂SO₄、NH₄NO₃、NaNO₃、花生餅粉、黃豆餅粉或玉米漿。

4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：步驟（3）中發酵24～28小時把搖床轉速提高到220～230轉每分以提高發酵液的通氣量；在發酵72～120小時補加植物油，植物油的加入質量與發酵培養基裝液量體積比為0.1～0.3克/升；特徵前體的加入質量與發酵培養基裝液量體積比為0.2～0.4克/升；其中所述的植物油為豆油或芝麻油；所述的特徵前體為氨基乙酸或甲羥戊酸。

實施方式

實施案例1

平板培養：將赤黴菌NJYHWG32261菌種接到PDA培養基上，在pH6.0，溫度為32℃，培養2天，得到活化的赤黴菌菌落；其中PDA培養基的組成為（克/升）：土豆汁250、葡萄糖10、瓊脂15；

種子培養：從PDA培養基上挑1個活化的赤黴菌菌落到裝種子培養基的搖瓶中，在pH6.0，培養溫度為32℃，搖床轉速為160轉每分，培養2天，得到種子液；其中種子培養基的裝液量為搖瓶體積的10%；種子培養基為（克/升）：葡萄糖30、NH₄NO32.0、MgSO₄·7H₂O1.0、KH₂PO₄·3H₂O1.0；

發酵培養：將種子液按發酵培養基體積的5%比例接種於裝發酵培養液的搖瓶中，pH為6.0，培養溫度為32℃，搖床轉速為160轉每分，在發酵28小時把搖床轉速提高到220轉每分以提高發酵液的通氣量，在發酵120小時補加0.1克/升豆油、0.4克/升氨基乙酸（補加物料的質量與發酵培養基裝液量體積比），培養8天得到發酵液；其中發酵培養基的裝液量為搖瓶體積的10%；發酵培養基為（克/升）：30.0葡萄糖、30.0糊精、0.5（NH₄）₂SO₄、0.8MgSO₄·7H₂O、0.5KH₂PO₄·3H₂O、3NaCl；HPLC檢測發酵液中提取的GA混合物發現含有70.02%的GA₄₊₇，GA₄:GA₇為3.7:1.2。

實施案例2

平板培養：將赤黴菌NJYHWG32261菌種接到PDA培養基上培養，在pH6.5，培養溫度為28℃，培養3天，得到活化的赤黴菌菌落；其中PDA培養基的組成為（克/升）：土豆汁150、葡萄糖30、瓊脂20；

種子培養：從PDA培養基上挑2個活化的赤黴菌菌落到裝種子培養基的搖瓶中，在pH6.5，培養溫度為28℃，搖床轉速為180轉每分，培養3天，得到種子液；其中種子培養基的裝液量為搖瓶體積的15%；種子培養基為（克/升）：葡萄糖40、NH₄NO₃1.0、MgSO₄·7H₂O0.8、KH₂PO₄·3H₂O0.5；

發酵培養：將種子液按發酵培養基體積的8%比例接種於裝發酵培養液的搖瓶中，pH為6.5，培養溫度為28℃，搖床轉速為180轉每分，在發酵24小時把搖床轉速提高到225轉每分以提高發酵液的通氣量；在發酵72小時補加0.2克/升芝麻油、0.3克/升甲瓦龍酸（補加物料的質量與發酵培養基裝液量體積比），培養6天得到發酵液；其中發酵培養基的裝液量為搖瓶體積的15%；發酵培養基為（克/升）：40.0蔗糖、20.0澱粉水解液、0.75花生餅粉、1.0MgSO₄·7H₂O、0.75KH₂PO₄·3H₂O、4NaCl；HPLC檢測發酵液中提取的GA混合物發現含有83.10%的GA₄₊₇，GA₄:GA₇為5.6:1.9。

實施案例3

平板培養：將赤黴菌NJYHWG32261菌種接到PDA培養基上培養，在pH7.0，培養溫度為26℃，培養4天得到活化的赤黴菌菌落；其中PDA培養基的組成為（克/升）：土豆汁200、葡萄糖20、瓊脂18；

種子培養：從PDA培養基上挑1個活化的赤黴菌菌落到裝種子培養基的搖瓶中，在pH7.0，培養溫度為26℃，搖床轉速為200轉每分，培養4天得到種子液；其中種子培養基的裝液量為搖瓶體積的20%；種子培養基為（克/升）：葡萄糖50、NH₄NO₃1.5、MgSO₄·7H₂O1.2、KH₂PO₄·3H₂O0.8；

發酵培養：將種子液按發酵培養基體積的10%比例接種於裝發酵培養液的搖瓶中，pH為7.0，培養溫度為26℃，搖床轉速為200轉每分，；在發酵26小時把搖床轉速提高到230轉每分以提高發酵液的通氣量；在發酵96小時補加0.3克/升芝麻油、0.2克/升氨基乙酸（補加物料的質量與發酵培養基裝液量體積比），培養7天得到發酵液；其中發酵培養基的裝液量為搖瓶體積的20%；發酵培養基為（克/升）：50.0乳糖、10.0糊精、1.0的玉米漿、1.2MgSO₄·7H₂O、1.0KH₂PO₄·3H₂O、5NaCl；HPLC檢測發酵液中提取的GA混合物發現含有72.00%的GA₄₊₇，GA₄:GA₇為2.7:0.8。

榮譽表彰