《一種蟾蜍噻嚀的提取方法》是安徽金蟾生化股份有限公司於2012年2月22日申請的專利，該專利申請號為2012100395064，公布號為CN102603742A，公布日為2012年7月25日，發明人是高波、羅川。
《一種蟾蜍噻嚀的提取方法》具體包括如下步驟：取乾蟾皮洗淨，加水5～8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。水提物上大孔樹脂柱，用水洗脫，之後用下述有機溶劑中的一種或多種與水作為洗脫劑進行梯度洗脫：乙醇、甲醇和丙酮，收集洗脫部分，減壓濃縮，乾燥，經矽膠柱層析、ODS柱層析分離，合併蟾蜍噻嚀流份，結晶，得蟾蜍噻嚀純品。該發明所得蟾蜍噻嚀純度和收率較高，且工藝簡單，易於大量生產。
2016年1月，《一種蟾蜍噻嚀的提取方法》獲得安徽省第四屆專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名： 一種蟾蜍噻嚀的提取方法
- 公布號：CN102603742A
- 公布日：2012年7月25日
- 申請號：2012100395064
- 申請日：2012年2月22日
- 申請人：安徽金蟾生化股份有限公司
- 地址：安徽省淮北市人民路298號
- 發明人：高波、羅川
- Int.Cl.：C07D471/06(2006.01)I
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
蟾皮為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo garfgarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufomelanostictus Schneider的乾燥全皮。乾蟾皮具有清熱解毒、消腫止痛、活血化瘀、軟堅散結的作用，主要含有蟾毒靈（buffalin）、脂蟾毒配基（resibufogenin）、華蟾酥毒基（cinobufagin）等內酯類成分，蟾蜍色胺（bufotenldine）、5-羥色胺（serotonine）、蟾蜍噻嚀（bufothionine）、去氫蟾蜍色氨氫溴酸（dehydrobufoteinine hydrobromide） 等水溶性蟾毒色胺類成分，蟾蜍環醯胺B、蟾蜍環醯胺C、蟾蜍環醯胺D等其他胺類成分，膽甾醇、7α-羥基膽甾醇、7β-羥基膽甾醇、β-谷甾醇、麥角甾醇及菜油甾醇等甾族化合物、以及胺基酸、有機酸、腎上腺素、嗎啡、多肽及多糖等其他成份。截至2012年2月，以蟾皮水溶性成分為主開發的製劑主要有華蟾素注射液、華蟾素片劑、華蟾素口服液等。
這些製劑在提取分離純化的過程中，許多內酯類成分都被除去了，而含量較高的蟾蜍噻嚀可能是華蟾素起作用的主要成分。以往華蟾素僅僅對總生物鹼進行含量控制，而大量蟾蜍噻嚀並沒有進行有效控制。採用高效液相色譜法測定蟾蜍噻嚀的含量，作為華蟾素的成分控制指標，不失為一種較好的方法。由於採用高效液相色譜法測定蟾蜍噻嚀的含量需要用蟾蜍噻嚀作為對照，因此如何提取蟾蜍噻嚀單體並達到含量測定對照品的要求已成為關鍵。在乾蟾皮藥材中，蟾蜍噻嚀的得率是較高的，大約20千克藥材中可以提取500毫克，遠遠超過蟾蜍環醯胺B（10毫克）、蟾蜍環醯胺C（6毫克）、去氫蟾蜍色氨氫溴酸鹽（20毫克）等其他成份。申請人（即安徽金蟾生化股份有限公司）進行了相關文獻檢索發現，從蟾皮中提取分離蟾蜍噻嚀單體的方法尚未進行報導，該發明提供了一種蟾蜍噻嚀單體的提取分離方法。
發明內容
技術方案
《一種蟾蜍噻嚀的提取方法》提供的所述蟾蜍噻嚀分子式：C12H14N2O4S，分子量：282.07，所述蟾蜍噻嚀結構式如下：
所述蟾蜍噻嚀採用如下提取方法獲得：
取乾蟾皮洗淨，加水5～8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。粗提物用下述有機溶劑中的一種或多種與水作為洗脫劑進行大孔樹脂梯度洗脫：乙醇、甲醇和丙酮，收集洗脫部分，減壓濃縮，乾燥，經矽膠柱層析、ODS柱層析分離，合併蟾蜍噻嚀流份，結晶，得蟾蜍噻嚀純品。
（1）水提醇沉
取乾蟾皮10千克，洗淨，加水8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
（2）大孔樹脂柱層析
該發明中，所述的大孔樹脂可為極性或非極性大孔樹脂。經大量試驗摸索，該發明特別優選下述類型的大孔樹脂：SP207、SP825、HP-20、HP-2MG、XAD1600、D-101、AB-8、MCI或HPD。採用上述優選的大孔樹脂，產品純度和收率可得到尤為顯著的提高。層析柱的徑長比較佳為1:5～1:50。優選層析柱規格為φ50×500毫米或φ70×1000毫米。大孔樹脂的用量較佳的為上樣量的30～120倍。
步驟（1）結束後，將所得的粗提取上大孔樹脂柱。上樣方法可為常規的濕法上樣或乾法上樣，優選濕法上樣。採用濕法上樣時，優選以0.1～5倍體積/小時的流速上樣進柱。上樣溫度優先10～60℃。
上樣後，用水作洗脫劑進行洗脫，水的用量較佳的為1～8倍柱體積，用水洗脫的流速較佳的為1～5倍柱體積/小時，用水洗脫的溫度較佳的為10～60℃。
之後用下述有機溶劑中的一種或多種與水作為洗脫劑進行梯度洗脫：乙醇、甲醇和丙酮。根據所選用的大孔樹脂的極性，在體積比0%有機溶劑（即純水）和體積比為100%有機溶劑的濃度範圍內選擇洗脫梯度。每個梯度的洗脫液的用量較佳的為5～20倍柱體積。洗脫的流速較佳的為1～5倍柱體積/小時。選擇不同的洗脫劑和洗脫梯度時，收集的洗脫梯度範圍有所不同，以收集用體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、和水的混合液為展開劑，矽膠薄層層析板（TLC）上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分為準。梯度洗脫的溫度較佳的為10～60℃。
該發明一較佳實例中，選擇D101大孔樹脂，洗脫梯度依次為5%乙醇水溶液，40%乙醇水溶液，純乙醇，收集40%乙醇水溶液的洗脫部分；
該發明另一較佳實例中，選擇AB-8型大孔樹脂，洗脫梯度依次為5%丙酮水溶液，40%丙酮水溶液，純丙酮，收集40%丙酮水溶液的洗脫部分；
該發明另一較佳實例中，選擇HP-20大孔樹脂，洗脫梯度依次為20%甲醇水溶液，40%甲醇水溶液，純甲醇，收集20%甲醇水溶液的洗脫部分，以及部分40%甲醇水溶液的洗脫部分；
該發明另一較佳實例中，選擇SP207大孔樹脂，所述的梯度洗脫中，洗脫梯度依次為10%甲醇水溶液，50%甲醇水溶液，純甲醇，收集10%甲醇水溶液的洗脫部分，以及部分50%甲醇水溶液的洗脫部分；
上述較佳實例中，百分比為體積百分比。
（3）矽膠柱層析
經（2）大孔樹脂柱層析後，濃縮液要進行矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
（4）ODS柱層析
經（3）矽膠柱層析後，濃縮液要進行ODS柱層析，依次用純水，5%～10%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集5%～10%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
改善效果
《一種蟾蜍噻嚀的提取方法》純度和收率較高，工藝成熟，成本低，易於大量提取蟾蜍噻嚀。
權利要求
1. 《一種蟾蜍噻嚀的提取方法》其中所述蟾蜍噻嚀的分子式：C12H14N2O4S，分子量：282.07，所述蟾蜍噻嚀的結構式如下：
所述蟾蜍噻嚀採用如下的提取方法獲得：
（1） 取乾蟾皮洗淨，加水5～8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至85±5℃下相對密度為1.1～1.2，冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏；
（2） 將所得的粗提物上大孔樹脂柱，用水洗脫，之後用下述有機溶劑中的一種或多種與水作為洗脫劑進行梯度洗脫：乙醇、甲醇和丙酮，收集洗脫部分，減壓濃縮，乾燥，經矽膠柱層析、ODS柱層析分離，合併蟾蜍噻嚀流份，結晶，得蟾蜍噻嚀純品。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述的蟾皮原料為中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor。
3. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述的大孔樹脂為下述類型的大孔樹脂：SP207、SP825、HP-20、HP-2MG、XAD1600、D-101、AB-8、MCI或HPD。
4. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述的大孔樹脂的徑長比為1:5～1:50；大孔樹脂的用量為上樣量的30～130倍。
5. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於：將粗提物上大孔樹脂柱的上樣方法為濕法上樣，以0.1～5倍柱體積/小時的流速上樣進柱，上樣溫度為10～60℃。
6. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述用水洗脫時，水的用量為1～8倍柱體積，用水洗脫的流速為1～5倍柱體積/小時，梯度洗脫的溫度為10～60℃。
7. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述的梯度洗脫的洗脫梯度在體積比0%有機溶劑和體積比為100%有機溶劑的濃度範圍內選擇，每個梯度的洗脫液的用量為5～20柱體積，洗脫的流速為1～5倍柱體積/小時，梯度洗脫的溫度為10～60℃。
8. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於：
所述的大孔樹脂為SP825大孔樹脂，所述的梯度洗脫中，洗脫梯度依次為5%乙醇水溶液，40%乙醇水溶液，純乙醇，收集40%乙醇水溶液的洗脫部分；或者，所述的大孔樹脂為D101型大孔樹脂，所述的梯度洗脫中，洗脫梯度依次為5%丙酮水溶液，40%丙酮水溶液，純丙酮，收集40%丙酮水溶液的洗脫部分；或者，所述大孔樹脂為HP-20大孔樹脂，所述的梯度洗脫中，洗脫梯度依次為20%甲醇水溶液，40%甲醇水溶液，純甲醇，收集20%甲醇水溶液的洗脫部分，以及部分40%甲醇水溶液的洗脫部分；或者所述大孔樹脂為SP207大孔樹脂，所述的梯度洗脫中，洗脫梯度依次為10%甲醇水溶液，50%甲醇水溶液，純甲醇，收集10%甲醇水溶液的洗脫部分，以及部分50%甲醇水溶液的洗脫部分；百分比為體積百分比。
9. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述矽膠柱層析為，所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，收集以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為展開劑，矽膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述ODS柱層析分離為，所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，5%～10%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集5%～10%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
實施方式
- 實施例1
1）取乾蟾皮10千克，洗淨，加水8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
2）層析柱尺寸為φ50×500毫米，內部裝填SP207大孔樹脂（上樣量120倍）。下述操作中，溫度控制在45℃。將水提液以0.5倍床層體積/小時的流速通入層析柱中。進料完成後先用5倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速1倍床層體積/小時，然後分別用10%、50%的甲醇水溶液和純甲醇依次梯度洗脫，每個梯度用量為8倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集收集10%甲醇水溶液的洗脫部分，以及部分50%甲醇水溶液的洗脫部分。
3）所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
4）所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，10%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集10%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
- 實施例2
1）取乾蟾皮10千克，洗淨，加水8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
2）層析柱尺寸為φ70×1000毫米，內部裝填SP825大孔樹脂（上樣量50倍）。下述操作中，溫度控制在25℃。將水提液以0.1倍床層體積/小時的流速通入層析柱中。進料完成後先用5倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速2倍床層體積/小時，然後分別用5%、40%的乙醇水溶液和純乙醇依次梯度洗脫，每個梯度用量為5倍柱體積，流速為2倍床層體積/小時。收集40%乙醇水溶液的洗脫部分。
3）所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
4）所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集5%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
- 實施例3
1）取乾蟾皮10千克，洗淨，加水8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
2）層析柱尺寸為φ50×500毫米，內部裝填HP-20大孔樹脂（上樣量100倍）。下述操作中，溫度控制在25℃。將水提液以0.5倍床層體積/小時的流速通入層析柱中。進料完成後先用8倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速1倍床層體積/小時，然後分別用20%、40%的甲醇水溶液和純甲醇依次梯度洗脫，每個梯度用量為10倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集收集20%甲醇水溶液的洗脫部分，以及部分40%甲醇水溶液的洗脫部分。
3）所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
4）所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集5%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
- 實施例4
1）取乾蟾皮10千克，洗淨，加水8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
2）層析柱尺寸為φ70×1000毫米，內部裝填HP-2MG大孔樹脂（上樣量60倍）。下述操作中，溫度控制在25℃。將水提液以5倍床層體積/小時的流速通入層析柱中。進料完成後先用8倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速1倍床層體積/小時，然後分別用20%、40%的甲醇水溶液和純甲醇依次梯度洗脫，每個梯度用量為10倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集收集20%甲醇水溶液的洗脫部分，以及部分40%甲醇水溶液的洗脫部分。
3）所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
4）所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集5%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
- 實施例5
1）取乾蟾皮10千克，洗淨，加水8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
2）層析柱尺寸為φ50×500毫米，內部裝填XAD1600大孔樹脂（上樣量80倍）。下述操作中，溫度控制在25℃。將水提液以2倍床層體積/小時的流速通入層析柱中。進料完成後先用8倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速4倍床層體積/小時，然後分別用15%、35%的乙醇水溶液和55%乙醇依次梯度洗脫，每個梯度用量為20倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集35%乙醇水溶液的洗脫部分。
3）所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
4）所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集5%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
- 實施例6
1） 取乾蟾皮10千克，洗淨，加水5倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.（285±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
2） 層析柱尺寸為φ50×500毫米，內部裝填D101大孔樹脂（上樣量50倍）。下述操作中，溫度控制在30℃。將水提液以0.5倍床層體積/小時的流速通入層析柱中。進料完成後先用4倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速2倍床層體積/小時，然後分別用5%、40%的乙醇水溶液和純乙醇依次梯度洗脫，每個梯度用量為5倍柱體積，流速為2倍床層體積/小時。收集40%乙醇水溶液的洗脫部分。
3） 所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集5%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
- 實施例7
1）取乾蟾皮10千克，洗淨，加水6倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
2）層析柱尺寸為φ50×500毫米，內部裝填AB-8大孔樹脂（上樣量80倍）。下述操作中，溫度控制在30℃。將水提液以0.3倍床層體積/小時的流速通入層析柱中。進料完成後先用6倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速5倍床層體積/小時，然後分別用5%、40%的丙酮水溶液和純丙酮依次梯度洗脫，每個梯度用量為7倍柱體積，流速為5倍床層體積/小時。收集40%丙酮水溶液的洗脫部分。
3）所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
4）所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，10%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集10%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
- 實施例8
1）取乾蟾皮10千克，洗淨，加水8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
2）層析柱尺寸為φ50×500毫米，內部裝填MCI大孔樹脂（上樣量90倍）。下述操作中，溫度控制在25℃。將水提液以0.5倍床層體積/小時的流速通入層析柱中。進料完成後先用5倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速2倍床層體積/小時，然後分別用5%、40%的乙醇水溶液和純乙醇依次梯度洗脫，每個梯度用量為10倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集40%乙醇水溶液的洗脫部分。
3）所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
4）所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集5%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
- 實施例9
1）取乾蟾皮10千克，洗淨，加水8倍，煎煮二次，第一次45分鐘，第二次30分鐘，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1～1.2（85±5℃），冷卻至40℃，加乙醇使含醇量達60%，攪勻，靜置24小時，取上清液回收乙醇至無醇味，加乙醇使含醇量達85%，攪勻，靜置48小時，濾過，回收乙醇至稠膏。
2）層析柱尺寸為φ50×500毫米，內部裝填HPD大孔樹脂（上樣量90倍）。下述操作中，溫度控制在25℃。將水提液以0.5倍床層體積/小時的流速通入層析柱中。進料完成後先用1倍柱體積的去離子水洗脫層析柱，流速1倍床層體積/小時，然後分別用10%、40%的乙醇水溶液和70%乙醇依次梯度洗脫，每個梯度用量為10倍柱體積，流速為1倍床層體積/小時。收集40%乙醇水溶液的洗脫部分。
3）所得大孔樹脂洗脫液經矽膠柱層析，以體積比為80:20:2.5的氯仿、甲醇、水為洗脫劑，收集體積比為4:1:5的正丁醇、乙酸和水的混合溶液靜止分層的上層溶液為展開劑，膠薄層層析板上Rf值為0.2～0.5的洗脫部分。
4）所得矽膠柱層析洗脫液經ODS柱層析，依次用純水，5%乙腈水溶液，50%乙腈水溶液梯度洗脫，收集5%乙腈水溶液洗脫部分，結晶，得到蟾蜍噻嚀純品。
榮譽表彰
2016年1月，《一種蟾蜍噻嚀的提取方法》獲得安徽省第四屆專利獎優秀獎。
