一種脂肪酶LIP及其基因和套用

《一種脂肪酶LIP及其基因和套用》是廣東溢多利生物科技股份有限公司於2012年11月1日申請的專利，該專利的公布號為CN103074315A，申請公布日為2013年5月1日，發明人是王建榮、李陽源、羅長財、鐘開新、陳麗芝。該發明涉及基因工程領域。

《一種脂肪酶LIP及其基因和套用》其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示。該發明是為了解決2012年11月之前技術的不足，從黑麴黴中克隆得到一種脂肪酶基因。該脂肪酶在畢赤酵母中的高效表達，可達到比2012年11月之前的技術更高的表達水平。因此，該發明的重組脂肪酶在工業生產中可降低生產成本，使其在洗滌、造紙、食品等工業中顯示出更大套用潛力。

2017年12月11日，《一種脂肪酶LIP及其基因和套用》獲得第十九屆中國專利優秀獎。

基本介紹

• 中文名：一種脂肪酶LIP及其基因和套用
• 申請人：廣東溢多利生物科技股份有限公司
• 申請日：2012年11月1日
• 申請號：2012104312431
• 公布號：CN103074315A
• 公布日：2013年5月1日
• 發明人：王建榮、李陽源、羅長財、鐘開新、陳麗芝
• 地址：廣東省珠海市南屏科技工業園屏北一路8號
• 分類號：C12N9/20(2006.01)I、C12N15/55(2006.01)I、C12N15/63(2006.01)I、C12N15/81(2006.01)I、C12R1/84(2006.01)N
• 代理機構：北京法思騰智慧財產權代理有限公司
• 代理人：高宇
• 類別：發明專利

專利背景

脂肪酶（Lipase，E.C.3.1.1.3），全稱為三醯基甘油醯水解酶（triacylglycerolacylhydrolase），它屬於α/β摺疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶催化三醯甘油的酯鍵水解，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶具有優良的立體選擇性，反應條件溫和並且不會造成環境污染，因此在洗滌、食品、造紙等許多工業領域中均有廣泛的套用。

脂肪酶廣泛的存在於動植物和微生物中，相對於動植物，微生物分泌的脂肪酶具有更廣的底物專一性、作用溫度以及作用PH範圍。雖然微生物分泌的脂肪酶具有很好的套用特性，但是尋找到適於工業化大生產的脂肪酶生產菌株還是十分困難。通過傳統誘變育種以及最佳化發酵條件，可以一定程度的提高微生物產脂肪酶的能力，然而脂肪酶產量和活力的突破性提高還需要依賴於基因工程。2012年前，在基因工程操作過程中一般選用大腸桿菌、釀酒酵母和畢赤酵母作為脂肪酶基因的表達宿主。由於在大腸桿菌中表達產量較低，蛋白易形成包涵體，產業化生產困難。因此採用真核生物，如釀酒酵母和畢赤酵母等作為表達宿主成為當前的主要趨勢。到2012年前為止已有多種微生物的脂肪酶基因在畢赤酵母中實現了異源表達，如溜麴黴、米根霉、擴展青黴等，表達的酶活分別為20U/毫升、231U/毫升和260U/毫升。關於黑麴黴脂肪酶的研究報導主要是集中在酶的分離純化、固定化以及套用，關於其基因的克隆與表達方面的報導很少，僅有的報導中也只是將黑麴黴脂肪酶基因轉化到大腸桿菌和畢赤酵母，並沒有詳細的研究重組工程菌株的酶活力以及酶學性質。總體上來說，2012年前所報導的脂肪酶重組酶的酶活力普遍較低，生產成本較高。因此篩選高比活酶基因，構建高效產酶微生物，進行基因改良，最佳化酶的性質，是當前亟待解決的問題。

發明內容

專利目的

《一種脂肪酶LIP及其基因和套用》的目的是提供一種來源於黑麴黴的脂肪酶。該發明的再一目的是提供上述脂肪酶的基因。該發明的再一目的是提供包含上述脂肪酶的重組載體。該發明的再一目的是提供包含上述脂肪酶的重組菌株。該發明的再一目的是提供一種高效表達脂肪酶的方法。該發明的再一目的是提供上述脂肪酶的套用。

技術方案

《一種脂肪酶LIP及其基因和套用》從黑麴黴中分離純化得到一種脂肪酶，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示：

胺基酸序列

該酶基因完整的開放閱讀框（ORF）為894bp，推測其編碼297個胺基酸，經分析發現其N端前19個胺基酸為信號肽序列。將克隆得到的黑麴黴脂肪酶LIP同已經報導的脂肪酶的胺基酸序列進行分析，發現該黑麴黴脂肪酶LIP也具有高度保守的脂肪酶活性中心催化三聯體的三個胺基酸殘基（Ser、Asp和His），並且Ser殘基位於“-G-H-S-L-G-”的保守五肽中。構成脂肪酶LIP的第一個氧陰離子洞區的胺基酸殘基序列也具有高度的保守性（VVAFRGS）。該發明獲得的脂肪酶最適溫度為50℃，最適反應pH值為7.0，與已報導的黑麴黴的脂肪酶相比具有更強的耐鹼性。該酶在pH4.0~9.0的條件下酶活穩定。此外，該重組酶的熱穩定性較好，在65℃水浴中放置1小時酶活力仍能保持60%以上。因此該酶可廣泛套用洗滌、造紙等工業領域。

該發明還提供了編碼上述脂肪酶的基因的序列如SEQIDNO.2所示：

肪酶的基因的序列

該發明通過生物信息學分析，採用同源克隆的方法分離得到上述脂肪酶基因，該基因全長894bp，其中1-57bp為信號肽序列。該發明還提供了包含上述脂肪酶基因的重組表達載體，命名為pPICzαA-lip。將該發明的脂肪酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列與可操作的與表達調控序列相連線。作為該發明的一個最優選的實施方案，優選為將該發明的脂肪酶基因插入到質粒pPICzalphaA上的EcoRI和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位於AOX1啟動子的下游並受其調控，得到重組酵母表達質粒pPICzαA-lip。該發明還提供了包含上述脂肪酶基因的重組菌株，優選重組菌株是畢赤酵母菌株X33。

該發明還提供了一種高效表達上述脂肪酶基因的方法，包括以下步驟：

1）用上述的重組載體轉化畢赤酵母細胞，得重組菌株；

2）重組菌株在發酵罐中進行發酵，誘導重組脂肪酶的表達；

3）發酵結束後，回收並純化所表達的脂肪酶。

其中，重組菌株在發酵罐中的發酵過程可分為3個階段：第一階段為菌體培養階段，按5%~10%的比例接入種子，培養24-30小時，以補完葡萄糖為標誌；第二階段為飢餓階段，當葡萄糖補完之後，不流加任何碳源，當溶氧上升至80%以上即表明該階段結束，為期約30~60分鐘；第三階段為誘導表達階段，流加誘導培養基，並且保持溶氧在20%以上，培養時間在180~200小時之間。發酵結束後，發酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理後獲得粗酶液。利用該發明的方法高效表達上述的重組脂肪酶，可達到5000U/毫升的發酵水平，同2012年前已報導的相比，該發明的脂肪酶通過高效表達後能夠達到更高的表達水平。

改善效果

《一種脂肪酶LIP及其基因和套用》是為了解決2012年11月之前技術的不足，從黑麴黴中克隆得到一種脂肪酶基因。該脂肪酶在畢赤酵母中的高效表達，可達到比2012年11月之前的技術更高的表達水平。因此，該發明的重組脂肪酶在工業生產中可降低生產成本，使其在洗滌、造紙、食品等工業中顯示出更大套用潛力。

附圖說明

圖1脂肪酶活性檢測功能平板圖，紫外光下的YEPD-羅丹明B平板轉化子1，2：轉化子；CK：pPICzαA空載體對照轉化子；

圖2重組脂肪酶在50升罐中的發酵過程曲線；

圖3重組菌株分泌表達脂肪酶的SDS-PAGE圖譜，1：純化後的重組脂肪酶；M：蛋白標準；

圖4重組脂肪酶的最適反應溫度；

圖5重組脂肪酶的溫度耐受性；

圖6重組脂肪酶的最適反應pH值；

圖7重組脂肪酶的pH耐受性；

圖8金屬離子和EDTA對重組脂肪糖酶酶活力的影響。

權利要求

1.一種脂肪酶LIP，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一種脂肪酶基因lip，其特徵在於，編碼權利要求1所述的脂肪酶LIP。

3.如權利要求2所述的脂肪酶基因lip，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNO. 2所示。

4.包含權利要求2所述的脂肪酶基因lip的重組載體。

5.根據權利要求4所述重組載體為pPICZaA。

6.一種高效表達脂肪酶LIP的方法，其特徵在於，包括以下步驟：

1）用權利要求4所述的重組載體轉化畢赤酵母細胞，得重組菌株；

2）重組菌株在發酵罐中進行發酵，誘導重組脂肪酶的表達；

3）發酵結束後，回收並純化所表達的重組脂肪酶LIP。

7.權利要求1所述的脂肪酶LIP在洗滌、造紙、食品工業中的套用。

實施方式

以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實驗材料和試劑：

1、菌株與載體

大腸桿菌菌株Topl0、畢赤酵母X33、載體pPICzalphaA購自Invitrogen公司，載體pMD18-T購自TaKaRa公司。

2、酶與試劑盒

逆轉錄酶SuperScriptIII、RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司。質粒DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，PCR純化試劑盒購自上海生工公司。限制性內切酶購自Fermentas公司。

3、培養基

基本鹽培養基：磷酸氫二銨5%、磷酸二氫鉀0.5%、七水硫酸鎂1.5%、硫酸鉀1.95%、硫酸鈣0.1%、氫氧化鉀0.1%、消泡劑0.03%。高壓後每升加4.35毫升PTM1。

PTM1（微量鹽溶液）：硫酸銅0.6%、碘化鉀0.018%、一水硫酸錳0.3%、二水鉬酸鈉0.02%、硼酸0.002%、六水氯化鈷0.05%、氯化鋅2%、七水硫酸鐵6.5%、濃硫酸0.5%、生物素0.02%。

實施例1

黑麴黴Aspergillusniger脂肪酶基因lip的克隆及其序列分析：運用RNA提取試劑盒，提取黑麴黴Aspergillusniger總RNA，按照逆轉錄酶SuperScriptIIIReverseTranscriptase操作說明合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，設計擴增脂肪酶基因的引物進行PCR擴增，將PCR產物由限制性內切酶EcoRI和NotI進行雙酶切，然後與經過同樣酶切的畢赤酵母表達載體pPICzalphaA相連線，連線產物轉化大腸桿菌Topl0感受態細胞，經抗生素Zeocin篩選後，獲得陽性克隆。提取陽性克隆的質粒。送樣到上海英駿生物公司測序，測序結果表明，獲得克隆DNA插入片段含有脂肪酶基因完整的開放閱讀框。該脂肪酶基因lip，全長894bp（SEQIDNo.2），編碼297個胺基酸（SEQIDNo.1），得到的重組表達載體命名為pPICzαA-lip，所用引物序列如下：

正向引物（含EcoRI酶切位點）：5'-ATCGGAATTCATGTTCTCTGGACGGTTTGGAGT-3'

反向引物（含NotI酶切位點）：5'-ATATGCGGCCGCCTATAGCAGACACTCTGAAATTG-3'

實施例2

包含脂肪酶基因lip的畢赤酵母工程菌的構建：將上述重組表達載體pPICzαA-lip用SacI進行線性化，線性化後的重組載體電擊轉化畢赤酵母X33，得到畢赤酵母重組菌株轉化子，用牙籤將轉化子轉接到YPDZ培養基平板上，28℃培養2天，用牙籤再將YPDZ培養基平板上的菌落轉接至脂肪酶活性檢測功能平板上，滴加甲醇進行誘導培養，定時觀察脂肪酶活性檢測功能平板的變化。實驗結果如圖1所示，轉化子1和2周圍有明顯的顯色圈，說明導入到畢赤酵母X33內的脂肪酶基因實現了功能性表達並分泌到細胞外。

實施例3

脂肪酶重組菌株的高效表達：將上述重組菌單菌落進行高密度發酵培養。配製20升基本鹽培養基，在50升自動控制發酵罐中滅菌後，冷卻至常溫備用。用氨水和磷酸調節發酵液的pH值至4.8，通過調節轉速和空氣流量控制溶氧大於30%，發酵溫度為30℃。整個發酵過程分3個階段：第一階段為菌體培養階段，將重組菌按照10%的接種量接種至發酵罐中，流加已滅菌的4升50%的葡萄糖，培養24~30小時，以補完葡萄糖為標誌；第二階段為飢餓階段，當葡萄糖補完之後，不流加任何碳源，當溶氧上升至80%以上即表明該階段結束，為期約30~60分鐘；第三階段為誘導表達階段，流加誘導培養基，並且保持溶氧在20%以上，培養時間在160~190小時之間。發酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理後獲得酶液。在發酵過程中的不同時間點取樣測定酶活，發酵過程中脂肪酶的表達情況如圖2所示，誘導培養180小時的發酵液酶活為5000U/毫升。

實施例4

重組脂肪酶的LIP活性分析：脂肪酶活力測定採用橄欖油乳化液水解滴定法，酶活定義：脂肪酶在40℃、pH8.0的條件下水解橄欖油乳化液產生1微摩爾/分鐘脂肪酸所消耗的酶量，即為1個脂肪酶活力單位。實驗設三次重複，每個樣品測定均設三個平行實驗，相對誤差控制在8％以內。

實施例5

重組脂肪酶LIP的性質測定

1、重組脂肪酶LIP的分離純化及其分子量大小

將上述發酵液中的脂肪酶通過硫酸銨分級沉澱、充分透析、再通過離子交換柱（QSepharoseFastFlowIonExchanger）層析純化，將純化後的蛋白液進行12％SDS－PAGE檢測（見圖3）。

2、重組脂肪酶LIP的最適反應溫度及溫度穩定性測定

在20℃~80℃下，以10℃為間隔，分別測定脂肪酶的活力，以在50℃的酶活力為基礎，其它溫度下測得的酶活與之相比，即得到該溫度下的相對酶活。結果如圖4，脂肪酶作用的最適合溫度為50℃。將脂肪酶酶液在不同溫度（30℃~80℃）下保溫1小時，測定殘留脂肪酶活力，以未處理的酶活力為對照，其它溫度下測得的酶活與之相比，即得到該溫度下剩餘的相對酶活。結果如圖5：此脂肪酶在65℃以下較穩定，保溫1小時後剩餘酶活可達到60%以上，超過此溫度脂肪酶的活性急劇下降，在70℃處理1小時後，剩餘酶活僅為38%。

3、重組脂肪酶LIP的最適pH和pH穩定性

在不同pH值（4.0~11.0）的緩衝液體系中分別測定脂肪酶的酶活力，以pH值7.0的酶活力為基礎，其它pH值下測得的酶活與之相比，即得到該pH值下的相對酶活。結果如圖6所示：該脂肪酶作用的最適pH值為7.0。向上述不同pH值緩衝液體系中分別加入稀釋好的酶液，室溫處理2h，測定殘留脂肪酶活力，以未處理的酶活力為對照。測定結果表明：該酶的pH穩定範圍較廣，在pH4.0~9.0範圍內性質穩定，當pH值大於9.0後其酶活急劇下降。

4、金屬離子和EDTA對酶活力的影響

將含有1mMFe、Fe、Ca、Mg、Co、Al、Cu和EDTA的溶液與稀釋適當倍數的酶液混合，室溫放置30分鐘，以未處理的酶液為對照，測定脂肪酶的相對酶活。結果如圖8所示，在供試的9種金屬離子中，1mM的Fe、Fe和Al對該酶的活性有顯著抑制作用，而1mMCa、Mg、Co對該酶有激活作用，Cu和EDTA對該酶酶活影響不顯著。

序列表

榮譽表彰

2017年12月11日，《一種脂肪酶LIP及其基因和套用》獲得第十九屆中國專利優秀獎。