《一種產α-酮戊二酸酵母工程菌及其構建方法》是江南大學於2010年12月8日申請的專利，該專利的申請號為2010105785946，公布號為CN102071154A，授權公布日為2011年5月25日，發明人是陳堅、殷曉霞、周景文、堵國成。
《一種產α-酮戊二酸酵母工程菌及其構建方法》採用分子手段，將來源於小鼠中編碼ATP-檸檬酸裂解酶ACL基因過量表達於發酵法生產a-酮戊二酸的菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06中，獲得了一株ATP-檸檬酸裂解酶活性提高的酵母工程菌Y.lipolytica ACL。與出發菌株相比：該發明提供的基因工程菌能以甘油為唯一碳源，在胞內積累0.89毫摩爾/升/克DCW的乙醯輔酶A，ACL活性提高了7.5倍（3.56U/毫克protein）；a-酮戊二酸產量達到45.3克/升，是出發菌株的1.29倍；丙酮酸產量降低到17.2克/升，是出發菌株的68.8%，具有廣闊的套用前景。
2014年11月6日，《一種產α-酮戊二酸酵母工程菌及其構建方法》獲得第十六屆中國專利金獎。
基本介紹
- 中文名：一種產α-酮戊二酸酵母工程菌及其構建方法
- 公布號：CN102071154A
- 公布日：2011年5月25日
- 申請號：2010105785946
- 申請日：2010年12月8日
- 申請人：江南大學
- 地址：江蘇省無錫市蠡湖大道1800號
- 發明人：陳堅、殷曉霞、周景文、堵國成
- Int.Cl.：C12N1/19（2006.01）I、C12N15/60（2006.01）I、C12N15/79（2006.01）I、C12P7/50（2006.01）I
- 代理機構：北京匯信合智慧財產權代理有限公司
- 代理人：王秀麗
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
a-酮戊二酸（a-ketoglutarate，a-KG），又稱a-膠酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸。分子式為C5H6O5，相對分子量為146.1，a-KG為白色或類白色的結晶或結晶性粉末，無色，易溶於水。a-KG在微生物細胞的代謝中起著重要的作用，是三羧酸循環（TCA）的重要中間產物之一，在生物體內參與胺基酸、蛋白質、維生素的合成以及能量代謝。a-KG在食品、醫藥、有機合成、化妝品和飼料等工業中都有著廣泛套用。
輔因子工程所涉及到的輔因子主要有：ATP/ADP/AMP、NADH/NAD、NADPH/NADP、輔酶A及其衍生物、維生素和微量元素。2010年12月前研究主要集中在調節ATP/ADP/AMP、NADH/NAD、NADPH/NADP和輔酶A及其衍生物等輔因子在細胞內的形式和含量對代謝途徑及代謝流量的影響。然而，對輔酶A如何影響工業微生物中碳代謝和碳代謝流流向分布的研究則鮮有報導。
發明內容
專利目的
《一種產α-酮戊二酸酵母工程菌及其構建方法》所要解決的技術問題是提供一種產a-酮戊二酸酵母工程菌。
所述工程菌過量表達ATP-檸檬酸裂解酶基因。
所述ATP-檸檬酸裂解酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述ATP-檸檬酸裂解酶基因克隆於載體pINA1269。
該發明所要解決的另一個技術問題是提供一種產a-酮戊二酸酵母工程菌的構建方法。
技術方案
為解決上述技術問題，《一種產α-酮戊二酸酵母工程菌及其構建方法》的具體方案為：
1）根據小鼠ATP-檸檬酸裂解酶基因序列設計引物克隆ACL基因；
2）利用In-FusionPCR技術將ACL基因與載體連線得到重組表達載體；
3）將得到的重組表達載體轉化解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）後得到酵母工程菌。
以下是該發明技術方案的詳細描述。
目的基因ACL擴增與表達質粒的構建：以帶有ACL基因的質粒為模板，PCR擴增得到ACL目的片段（大小約為3500bp）。利用In-FusionPCR技術將ACL基因與經P毫升I和BamHI酶切後的質粒pINA1269連線，得到ACL基因表達載體pINA1269-ACL。構建好的重組質粒經酶切分析，並進行DNA測序。基因測序結果與預期一致，表明重組質粒構建正確。
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）WSH-Z06△leu2菌株的構建：該發明的出發菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06是由本實驗的周海岩等人在2007年篩選出來的，現保藏與中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO:M20714，專利號為CN101215529A。
根據NCBI網站上Y.lipolytica的LEU2基因序列，設計兩對引物（L1，L2和R1，R2）分別擴增LEU2基因上下游約1000bp的片段。另外，以pUG66質粒為模板，PCR擴增兩端帶有loxP序列的Ble基因片段（大小約為1000bp），利用三個片段之間的同源序列進行融合PCR後與pMD18-T simple vector（Takara）連線，得到重組質粒。重組質粒轉化大腸桿菌JM109，挑取能在Amp平板上生長的菌落以L1和R2為引物進行菌落PCR鑑定，得到大約為3000bp大小的條帶。菌落PCR驗證正確的轉化子提取質粒，以質粒上的通用引物進行測序，測序結果與預期一致，表明融合片段構建正確。質粒經BamHI酶切，膠回收大小約為3000bp的片段，得到LEU2基因敲除框，醋酸鋰法轉化Y.lipolytica WSH-Z06感受態細胞。將能在Zeocin平板上生長的菌落，提取全基因組作為模板，L1和R2為引物PCR擴增得到約3000bp大小的片段，表明該轉化子為亮氨酸營養缺陷型菌株。將質粒pUB4-CRE醋酸鋰法轉化亮氨酸營養缺陷型菌株，挑取能在Hyg平板上生長的菌落，分別連續點種與YPD、YPD+Hyg和YPD+Zeocin平板上。由於pUB4-CRE質粒表達的CRE能通過Cre-loxP系統將Ble基因從酵母基因組上剪除，而pUB4-CRE質粒本身不穩定，在轉接若干代後會自動消除。因此，轉接後能在YPD平板上生長，而不能在YPD+Hyg和YPD+Zeocin平板上生長的菌落即為不帶Ble抗性的亮氨酸營養缺陷型菌株Y.lipolytica WSH-Z06 △leu2。
過量表達ACL的Y.lipolytica酵母工程菌的篩選：將重組質粒pINA1269-ACL經Not I酶切，純化後，醋酸鋰法轉化Y.lipolytica WSH-Z06 △leu2感受態細胞。將能在MM平板上生長的菌落，在MM平板上連續轉接三代，得到遺傳穩定的酵母工程子。挑取陽性酵母工程子若干提基因組，利用引物ACL-F和ACL-R進行PCR驗證，得到大約3500bp的片段，表明ACL基因已成功整合到Y.lipolytica WSH-Z06 △leu2基因組中。所得酵母工程菌命名為Y.lipolytica ACL。該菌在以甘油為碳源的培養基上生長時，ACL酶活為3.56U/毫克protein，是出發菌株的7.5倍。
發酵培養基（克/升）：甘油100克，硫酸銨3克，磷酸二氫鉀3克，七水硫酸鎂1.2克，氯化鈉0.5克/升，磷酸氫二鉀0.1克，鹽酸硫胺0.2毫克，碳酸鈣20克（搖瓶時添加），自來水定容至1升。
種子培養基和發酵培養基的滅菌溫度為115-121℃，15分鐘。維生素等熱敏性材料配製後0.22毫米膜過濾除菌，接種前加入。
將實驗菌株接種到種子培養基中，500毫升搖瓶裝液50毫升，於28℃，200轉/分條件下培養20-24小時。
按10%的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，28℃，200轉/分條件下培養144小時。
細胞乾重的測定：10毫升容量瓶中，加2毫升鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，加入去離子水定容至10毫升，搖勻，用UV7500型可見分光光度計，於570納米處比色測OD值，用細胞乾重標準曲線算得細胞乾重。
甘油、丙酮酸和a-KG濃度的測定：高效液相色譜（HPLC）；儀器：Agilent1100高效液相色譜儀（配紫外可見檢測器、示差折光檢測器和工作站），色譜條件：色譜柱：A分鐘exHPX-87Hionexchangecolumn；流動相：5毫摩爾/升H2SO4；流速：0.6毫升/分鐘；柱溫：35℃；進樣量：5微升；紫外檢測器波長：210納米（檢測丙酮酸和a-KG）；示差折光檢測器：檢測甘油。
樣品製備：500微升發酵液在10000轉/分下離心10分鐘，取上清液移入1.5毫升離心管中測甘油、丙酮酸和a-KG的含量。取100微升上清液移入5毫升容量瓶中，超純水定容至刻度線，經0.45微米濾膜過濾，濾液供液相色譜分析。
改善效果
《一種產α-酮戊二酸酵母工程菌及其構建方法》通過過量表達ATP-檸檬酸裂解酶基因，改變胞內輔因子之一—乙醯輔酶A的存在形式和濃度，提供了一種輔因子調控碳代謝流實現a-酮戊二酸（a-KG）過量積累的方法。與出發菌株相比：該發明提供的基因工程菌能以甘油為唯一碳源，在胞內積累0.89毫摩爾/升/克DCW的乙醯輔酶A，ACL活性提高了7.5倍（3.56U/毫克protein）；在發酵144小時後，a-酮戊二酸產量達到45.3克/升，是出發菌株的1.29倍；丙酮酸產量降低到17.2克/升，是出發菌株的68.8%，具有廣闊的套用前景。
權利要求
1.一種產a-酮戊二酸酵母工程菌，其特徵在於包括如下步驟：
1）根據小鼠ATP-檸檬酸裂解酶基因序列設計引物克隆ACL基因；
2）構建解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）WSH-Z06△leu2菌株；其中解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）WSH-Z06的保藏於中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO:M20714；
3）利用In-FusionPCR技術將ACL基因與載體連線得到重組表達載體；
4）將得到的重組表達載體轉化解脂耶氏酵母WSH-Z06△leu2後得到酵母工程菌。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述ATP-檸檬酸裂解酶基因核昔酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述ATP-檸檬酸裂解酶基因克隆於載體pINA1269。
實施方式
實施例1 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）WSH-Z06△leu2菌株的構建與鑑定
根據NCBI網站上Y.lipolytica的LEU2基因序列（GenBank:M27209.1），設計兩對引物（L1，L2和R1，R2，見表1）分別擴增LEU2基因上下游約1000bp的片段。另外，以pUG66質粒為模板，Ble-F和Ble-R為引物（見表1），PCR擴增兩端帶有loxP序列的Ble基因片段，利用三個片段之間的同源序列進行融合PCR後與pMD18-Tsimplevector連線，得到重組質粒。重組質粒轉化大腸桿菌JM109，挑取能在Amp平板上生長的菌落以L1和R2為引物進行菌落PCR鑑定，得到大約為3000bp大小的條帶。菌落PCR驗證正確的轉化子提取質粒，以質粒上的通用引物進行測序，測序結果與預期一致，表明融合片段構建正確。質粒經BamHI酶切，膠回收大小約為3000bp的片段，得到LEU2基因敲除框，醋酸鋰法轉化Y.lipolyticaWSH-Z06感受態細胞。將能在Ble平板上生長的菌落，提取全基因組作為模板，L1和R2為引物PCR擴增得到約3000bp大小的片段，表明該轉化子為亮氨酸營養缺陷型菌株。將質粒pUB4-CRE醋酸鋰法轉化亮氨酸營養缺陷型菌株，挑取能在Hyg平板上生長的菌落，分別連續點種與YPD、YPD+Hyg和YPD+Ble平板上。由於pUB4-CRE質粒表達的CRE能通過Cre-loxP系統將Ble基因從酵母基因組上剪除，而pUB4-CRE質粒本身不穩定，在轉接若干代後會自動消除。因此，轉接後能在YPD平板上生長，而不能在YPD+Hyg和YPD+Ble平板上生長的菌落即為不帶Ble抗性的亮氨酸營養缺陷型菌株Y.lipolytica WSH-Z06 △leu2。
其中：YPD培養基（克/升），葡萄糖20克，Tryptone20克，Yeast extract10克，固體培養基添加20克瓊脂。
Hyg抗性平板（克/升），YPD+100毫克潮黴素，固體培養基添加20克瓊脂。
Zeocin抗性平板（克/升），YPD+100毫克博萊黴素，固體培養基添加20克瓊脂。
質粒pUB4-CRE由法國農業生物技術中心的Catherine Madzak教授所贈（Fickers et al.,2003），質粒pUG66該實驗保藏（GenBank:AF298794.1）。
Fickers，P.，Le Dall，M.T.，Gaillardin，C.，Thonart，P.，and Nicaud，J.M.（2003）.New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica.J Microbiol Methods 55，727-737.
引物名稱 | 序列（5’端→3’端） |
L1 | GGATCCATGCATTGCTTATTACGAAGACTACCCGTTGCTAT |
L2 | ATACATTATACGAAGTTATGAAGTCGCCGCCGAGAAGAACAATC |
R1 | TGTATGCTATACGAAGTTATGACTTGTTGCCAACAAGGTCAAGGA |
R2 | GGATCCAATTCATGTCACACAAACCGATCTTCGCCTCAAGG |
Ble-F | TTCTTCTCGGCGGCGACTTCATAACTTCGTATAATGTATGCTAT |
Ble-R | CAACGGTTGTTCCAGTTCCTATAACTTCGTATAGCATACATTATA |
ACL-F | ACCACACACATCCACATGTCAGCCAAGGCAATTTCAGAGC |
ACL-R | TTCCGTAGTTGGATCCTACATGCTCATGTGTTCTGGAAGAAC |
實施例2 酵母工程菌的構建及鑑定
以小鼠的cDNA為模板，ACL-F和ACL-R（見表1）為引物，PCR擴增得到ACL目的片段（大小約為3500bp）。利用In-FusionPCR技術將ACL基因與經P毫升I和BamHI酶切後的質粒pINA1269連線，得到ACL基因表達載體pINA1269-ACL，構建好的重組質粒經酶切分析，並進行DNA測序。基因測序結果與預期一致，表明重組質粒構建正確。將重組質粒pINA1269-ACL經Not I酶切，純化後，醋酸鋰法轉化Y.lipolytica WSH-Z06 △leu2感受態細胞。將能在MM平板上生長的菌落，在MM平板上連續轉接三代，得到遺傳穩定的酵母工程子。挑取陽性酵母工程子若干提基因組，利用引物ACL-F和ACL-R進行PCR驗證，得到大約3500bp的片段，表明ACL基因已成功整合到Y.lipolytica WSH-Z06 △leu2基因組中。所得酵母工程菌命名為Y.lipolyticaACL。該菌在以甘油為唯一碳源的培養基上生長時，能在胞內積累0.89毫摩爾/升/克DCW的乙醯輔酶A，ACL活性達到3.56U/毫克protein，是出發菌株的7.5倍。
其中：基本培養基MM（克/升），葡萄糖20克，Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and ammonium sulfate1.7克，硫酸銨5克，固體培養基添加20克瓊脂。
質粒pINA1269由法國農業生物技術中心的Catherine Madzak教授所贈（Madzak et al.，2004）。
Madzak，C.，Gaillardin，C.，and Beckerich，J.M.（2004）.Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica:a review.J Biotechnol 109，63-81.
實施例 3發酵生產
將基因工程菌及出發菌株接種到種子培養基中，500毫升搖瓶裝液50毫升，於28℃，200轉/分條件下培養20-24小時。按10%的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，28℃，200轉/分條件下培養144小時。
發酵144小時後，酵母工程菌和出發菌比較：（1）出發菌中a-KG產量為35.2克/升，酵母工程菌中a-KG產量可達45.3克/升，是出發菌的1.29倍；（2）出發菌中丙酮酸含量為25.0克/升，而酵母工程菌中丙酮酸含量為17.2克/升，副產物大量減少。
種子培養基（克/升）：葡萄糖20克，蛋白腖10克，磷酸二氫鉀1克，七水硫酸鎂0.5克，瓊脂20克（斜面用），pH5.5，自來水定容至1升。
發酵培養基（克/升）：甘油100克，硫酸銨3克，磷酸二氫鉀3克，七水硫酸鎂1.2克，氯化鈉0.5克/升，磷酸氫二鉀0.1克，鹽酸硫胺0.2毫克，碳酸鈣20克（搖瓶時添加），自來水定容至1升。
種子培養基和發酵培養基的滅菌溫度為115-121℃，15分鐘。維生素等熱敏性材料配製後0.22毫米膜過濾除菌，接種前加入。
榮譽表彰
2014年11月6日，《一種產α-酮戊二酸酵母工程菌及其構建方法》獲得第十六屆中國專利金獎。
