《一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法》是廣東希普生物科技股份有限公司於2014年7月2日申請的發明專利，該專利申請號為2014103149179，公布號為CN104073511A，公布日為2014年10月1日，發明人是查向東、車媛媛、程林春、趙大偉、余忠麗。
《一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法》所述表達載體是通過將牛乳鐵蛋白肽基因接入pYES2質粒中，並用TPI啟動子替代pYES2質粒的GAL1啟動子所得。該發明構建的pYES2-TPI–LfcinB重組質粒可以高效穩定地分泌表達牛乳鐵蛋白肽；且不需使用誘導劑，降低了生產成本和生產的複雜性。
2021年6月24日，《一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法
- 申請人：廣東希普生物科技股份有限公司
- 發明人：查向東、車媛媛、程林春、趙大偉、余忠麗
- 申請號：2014103149179
- 申請日：2014年7月2日
- 公布號：CN104073511A
- 公布日：2014年10月1日
- 地址：廣東省廣州市花都區華僑經濟開發實驗區
- 代理機構：廣州嘉權專利商標事務所有限公司
- 代理人：鄭瑩
- Int. Cl.：C12N15/81、C12N15/66、C12N1/19、C12P21/02、C12R1/865
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,專利榮譽,
專利背景
抗菌肽（也稱為宿主防禦肽）是一類在誘導條件下產生的，具有抗菌活性的兩性小分子多肽，存在於所有生物中的，進化上保守的先天免疫反應的組成部分。抗菌肽是宿主免疫防禦系統的重要組成部分。抗菌肽具有廣譜抗菌作用，對病毒、寄生蟲、癌細胞均有抑制作用。抗菌肽可以用於醫藥衛生、食品工業等方面。在醫藥衛生方面，抗菌肽與抗生素最大的不同之處在於抗菌肽的套用可以解決抗藥性的問題。隨著抗生素的濫用，解決抗藥性的問題已經被提上議事日程，而近年來“超級細菌”的出現，更是使這一問題雪上加霜。具有與抗生素完全不同殺菌機理的抗菌肽的套用或許可以為這些問題的解決提供途徑。在食品工業上抗菌肽的套用主要是食品添加劑。抗菌肽的殺菌能力很強，並且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有廣泛的殺菌作用，因此可以代替傳統的食品防腐劑，起到保鮮作用。同時又由於它是一種肽，可以被消化道消化、吸收對人體無害。此外，抗菌肽在、畜牧業、農業等各個方都有十分廣泛的套用。研究其大規模生產具有十分積極的意義。該課題旨在找到一種大規模生產抗菌肽的方法，構建工程菌，並對提高其產量等其他方面作出初步探索。
2014年7月前研究和使用的蛋白質的表達系統主要有原核表達系統和真核表達系統。原核表達系統以大腸桿菌為代表，真核表達系統又以酵母表達系統和動、植物表達系統為代表。這其中，尤以大腸桿菌為代表的的原核表達系統和以酵母菌為代表的真核表達系統是研究得最為透徹的。
原核表達：選用大腸桿菌偏好的密碼子，設計合成好抗菌肽基因，將抗菌肽基因克隆到含有蛋白伴體的專門的融合表達載體（如pET、pGEX、pGEM、pMAL等系列）然後轉化入相應的大腸桿菌宿主細胞，最後再經誘導、酶切而得到抗菌肽基因表達的蛋白。
真核分泌表達：抗菌肽的真核表達系統主要有酵母表達系統、哺乳動物細胞表達系統和植物細胞表達系統，酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達調控機制和對表達產物的加工修飾和分泌能力，並且不會產生內毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌。近年來套用最為廣泛的是畢赤酵母和釀酒酵母。隨著DNA重組技術的發展,釀酒酵母已被廣泛地套用於外源蛋白表達的宿主，其是真核生物，遺傳背景清楚，易操作，與日常生活密切，安全，無毒素，對生物和環境不會構成威脅，可進行蛋白翻譯後加工，同樣可進行通過插入信號肽獲得分泌表達，易於純化，且工藝簡單成本較低。但是傳統宿主菌存在的葡萄糖效應問題會影響誘導表達的效率，進而影響產量，時誘導表達所使用的誘導劑大大提高了生產成本。
發明內容
專利目的
《一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法》的一個目的在於提供一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體；該發明的另一個目的在於提供上述牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體的製備方法；該發明的另一個目的是提供一種牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達菌株；該發明的另一個目的是提供一種牛乳鐵蛋白肽的生產方法。
技術方案
《一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法》所採取的技術方案如下：
一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體，其是通過將牛乳鐵蛋白肽基因接入pYES2質粒中，並用磷酸丙糖異構酶（TPI）啟動子替代pYES2質粒的GAL1啟動子所得。
所述牛乳鐵蛋白肽基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
所述牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體的製備方法，包括如下步驟：
（1）PCR擴增TPI啟動子序列；
（2）PCR擴增不含GAL1啟動子的pYES2質粒序列；
（3）將上述兩個片段進行平末端連線，得到重組表達載體；
（4）將牛乳鐵蛋白肽基因序列插入到步驟（3）所得到的重組表達載體中，即得到pYES2-TPI–LfcinB重組質粒。
步驟（1）的操作為：以含有TPI啟動子序列的pYX212質粒為模板，利用引物TP1：5’-TCTTCAAGAATTGGGGA-3’和TP2：5’-CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG-3’進行PCR擴增。
步驟（2）的操作為：以pYES2質粒為模板，設計引物：Y1：5’-CCGGATCGGACTACTAGC-3’和Y2：5’-ACTAGTGGATCATCCCCAC-3’進行反向PCR以刪除pYES2質粒中的GAL1啟動子。
步驟（3）的操作為：將TPI啟動子PCR產物和缺失啟動子pYES2質粒PCR產物按2:1混合，用T4多聚核苷酸激酶進行磷酸化後，再用T4DNA連線酶連線。
步驟（4）的操作為：將步驟（3）得到的重組表達載體和牛乳鐵蛋白肽基因序列用EcoRI和XhoI核酸內切酶雙酶切4小時，並做粘性末端連線，即得到pYES2-TPI–LfcinB重組質粒。
一種牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達菌株，其是由上述的牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體轉化釀酒酵母INVSC1菌株所得。
一種牛乳鐵蛋白肽的生產方法，包括對上述的牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達菌株進行誘導培養，從而得到牛乳鐵蛋白肽。
改善效果
《一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法》通過替換啟動子的方法，獲得了一種可以組成型表達目的蛋白的釀酒酵母菌株。對於該發明來說，主要解決了如下問題：
（1）用組成型表達載體解決葡萄糖抑制效應問題，可以高效穩定地分泌表達牛乳鐵蛋白肽；
（2）不需使用誘導劑，降低了生產成本和生產的複雜性。
附圖說明
圖1為大腸桿菌DH5α抑菌活性圖，其中1為含pYES2-GAL1質粒的釀酒酵母培養12小時上清，2為含pYES2-TPI重組質粒的釀酒酵母培養12小時上清，3為水對照，4為SC-U釀酒酵母液體培養基，5為氨苄青黴素鈉。
圖1
技術領域
《一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法》屬於基因工程菌技術領域，具體涉及一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法。
權利要求
1.一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體，其是通過將牛乳鐵蛋白肽基因接入pYES2質粒中，並用磷酸丙糖異構酶（TPI）啟動子替代pYES2質粒的GAL1啟動子所得。
2.根據權利要求1所述的牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體，其特徵在於，所述牛乳鐵蛋白肽基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根據權利要求1或2所述的牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體，其特徵在於，所述牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體的製備方法，包括如下步驟：（1）PCR擴增TPI啟動子序列；（2）PCR擴增不含GAL1啟動子的pYES2質粒序列；（3）將上述兩個片段進行平末端連線，得到重組表達載體；（4）將牛乳鐵蛋白肽基因序列插入到步驟（3）所得到的重組表達載體中，即得到pYES2-TPI–LfcinB重組質粒。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟（1）的操作為：以含有TPI啟動子序列的pYX212質粒為模板，利用引物TP1：5’-TCTTCAAGAATTGGGGA-3’和TP2：5’-CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG-3’進行PCR擴增。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟（2）的操作為：以pYES2質粒為模板，設計引物：Y1：5’-CCGGATCGGACTACTAGC-3’和Y2：5’-ACTAGTGGATCATCCCCAC-3’進行反向PCR以刪除pYES2質粒中的GAL1啟動子。
7.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟（3）的操作為：將TPI啟動子PCR產物和缺失啟動子pYES2質粒PCR產物按2:1混合，用T4多聚核苷酸激酶進行磷酸化後，再用T4DNA連線酶連線。
8.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟（4）的操作為：將步驟（3）得到的重組表達載體和牛乳鐵蛋白肽基因序列用EcoRI和XhoI核酸內切酶雙酶切4小時，並做粘性末端連線，即得到pYES2-TPI–LfcinB重組質粒。
9.一種牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達菌株，其是由權利要求1～3任一項所述的牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體或由權利要求4-8任一項所述的方法製備得到的牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體轉化釀酒酵母INVSC1菌株所得。
10.一種牛乳鐵蛋白肽的生產方法，包括對權利要求9所述的牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達菌株進行誘導培養，從而得到牛乳鐵蛋白肽。
實施方式
- 實施例
一、一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體的構建
1、TPI啟動子基因的擴增：以含有TPI啟動子序列的pYX212質粒為模板，擴增引物為：
TP1：5’-TCTTCAAGAATTGGGGA-3’（SEQ ID NO.5）；
TP2：5’-CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG-3’（SEQ ID NO.6）。
反應條件：94攝氏度預變性5分鐘；94攝氏度30秒，53攝氏度30秒，72攝氏度93秒，30個循環；72攝氏度延伸10分鐘。反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收。
擴增得到的TPI啟動子的序列如SEQ ID NO.1所示。
2、PCR擴增不含GAL1啟動子的pYES2質粒序列：以pYES2質粒為模板，設計引物：Y1：5’-CCGGATCGGACTACTAGC-3’（SEQ ID NO.7）和Y2：5’-ACTAGTGGATCATCCCCAC-3’（SEQ ID NO.8），進行反向PCR以刪除pYES2質粒中的GAL1啟動子（如SEQ ID NO.2所示）。
反應條件：94攝氏度預變性5分鐘；94攝氏度45秒，59攝氏度45秒，72攝氏度572秒，15個循環；72攝氏度延伸10分鐘。反應產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收。
3、TPI啟動子和缺失GAL1啟動子的pYES2質粒的平末端連線：將TPI啟動子PCR產物和缺失啟動子pYES2質粒PCR產物按2:1混合，用T4多聚核苷酸激酶進行磷酸化後用T4DNA連線酶連線。反應產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收。
4、向重組質粒中插入牛乳鐵蛋白肽基因序列
將步驟（3）得到的重組表達載體和牛乳鐵蛋白肽基因序列（SEQ ID NO.3）用EcoRI和XhoI核酸內切酶雙酶切4小時，並做粘性末端連線，得到牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體pYES2-TPI–LfcinB，其序列如SEQ ID NO.4所示。
二、克隆轉化
（1）將重組質粒pYES2-TPI–LfcinB轉化DH5α感受態細胞，氨苄青黴素鈉篩選陽性克隆，少量提取質粒，並測序。
（2）取釀酒酵母INVSC1感受態細胞80微升，加入剛融化的測序正確的質粒10微升，充分混勻；再將菌液加入冰浴中的電擊杯，迅速電擊轉化；最後迅速將轉化菌塗布於SC-U固體培養基上，30攝氏度培養。
（3）轉化驗證：挑取SC-U固體培養基上的釀酒酵母單克隆菌落，接種於SC-U液體培養基中進行擴大培養，並取菌液進行PCR驗證，可以擴增出牛乳鐵蛋白肽基因和TPI啟動子片段即為轉化成功的陽性菌落。
三、培養表達及活性檢測
取陽性菌落的培養菌液在SC-U固體培養基中進行劃線，30攝氏度培養，以含有pYES2-GAL1–LfcinB重組質粒（沒有替換啟動子）的釀酒酵母作為對照。
挑取劃線的單克隆菌落接種於SC-U液體培養基中，30攝氏度培養12小時，做大腸桿菌DH5α抑菌活性試驗，試驗結果見圖1。試驗結果表明，pYES2-TPI–LfcinB重組質粒的抑菌圈的半徑顯著大於pYES2-GAL1–LfcinB重組質粒的抑菌圈，由此可見，pYES2-TPI–LfcinB重組質粒的表達活性得到了顯著提高。
Tricine-SDS-PAGE法鑑定抗菌肽牛乳鐵蛋白肽的表達效果，取12小時培養上清加10%的TCA濃縮，加20微升上樣緩衝液做SDS電泳檢測，檢測結果與預期一致。
以上實驗數據表明，《一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法》構建的pYES2-TPI–LfcinB重組質粒可以高效穩定地分泌表達牛乳鐵蛋白肽；且不需使用誘導劑，降低了生產成本和生產的複雜性。
專利榮譽
2021年6月24日，《一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達載體及其製備方法》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
