《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》是中國海洋大學於2014年1月3日申請的專利，該專利的公布號為CN103710365A，授權公布日為2014年4月9日，發明人是劉濤、池姍。
《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》涉及基因工程技術領域，具體是一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，該基因核苷酸序列及編碼蛋白質的胺基酸序列分別為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。該發明通過基因克隆技術克隆出基因序列，構建原核表達載體，通過對重組蛋白進行酶活性檢測，證實了其具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的功能，屬於瓊膠、澱粉、纖維素、海藻糖、蔗糖等合成途徑的關鍵酶編碼基因。該基因對於提高藻類瓊膠、澱粉、纖維素、海藻糖、蔗糖等經濟成分含量具有重要的套用價值。
2020年7月14日，《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因
- 申請人：中國海洋大學
- 申請號：2014100029438
- 申請日：2014年1月3日
- 公布號：CN103710365A
- 公布日：2014年4月9日
- 發明人：劉濤、池姍
- 地址：山東省青島市魚山路5號海洋生命學院地質館106室
- Int. Cl.：C12N15/55(2006.01)I、C12N9/14(2006.01)I、C12P19/04(2006.01)I
- 代理機構：靖江市靖泰專利事務所
- 代理人：陸平
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
海帶是全世界主要栽培的海洋植物（藻類）種類。作為一種海洋蔬菜，海帶具有很高的營養價值，同時，其含有的藻膠、澱粉、纖維素等經濟成分，可以作為原材料廣泛套用於食品、醫藥衛生、紡織工業、科學研究等方面。
克隆產物合成相關基因並驗證其功能，揭示基因與產物之間的關係，輔助開展品種改良已成為國際農業育種領域提高經濟成分含量的有效途徑之一；同時，利用基因工程技術生產活性物質與經濟產物已成為現代生物技術產業發展的核心內容。
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase，UDP-glucose pyrophosphorylase）是生物糖代謝過程中一個關鍵酶，在植物以及藻類中主要催化可逆反應Glc-1-P+UTP←→UDPG+PPi，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化反應的產物之一尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG，uridine diphosphate glucose）作為體內主要活化糖的形式，可作為葡萄糖基供體參與瓊膠、蔗糖、纖維素、半纖維素、海藻糖、果膠質、胼胝質以及糖脂、糖蛋白的合成代謝。
瓊膠、蔗糖、纖維素、半纖維素、海藻糖、果膠質、胼胝質以及糖脂、糖蛋白等不同物質的生物合成途徑不同，但都是以尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP酶）催化反應的產物尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）作為共有的初始反應底物。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）催化活力直接影響到尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）的含量水平，因此，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）被認為是一類重要的關鍵酶。
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP酶）廣泛存在於各種生物體內，如綠色植物（Green Plants）、高等動物（Animals）、硅藻（Diatom）、綠藻（Green algae）、褐藻（Brown algae）、紅藻（Red algae）、真菌（Fungi）、細菌（Bacteria）等。2014年前，已經在大量綠色植物和微生物中克隆出該酶的基因並驗證了其功能，但在藻類中該基因的克隆開展的還不多，僅有日本凋毛藻（Griffithsia japonica）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、龍鬚菜（Gracilariopsis lemaneiformis）、江蘺（Gracilaria gracilis）得到了克隆，但並未驗證該基因編碼酶的功能。
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）催化反應的產物之一尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）作為合成蔗糖、纖維素、半纖維素、果膠質等經濟成分的初始底物，使綠色植物成為提取上述物質的主要原料。同時，在合成重要海藻膠-瓊膠的生物合成中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）被認為是紅藻糖苷合成過程中的限速酶，控制著重要的產物UDP-D-葡萄糖的合成，對於提高紅藻中的瓊膠含量具有重要的價值，2014年前，植物中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）基因的功能驗證主要通過檢測其催化逆反應UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性，但關於紅藻、褐藻中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）基因的克隆十分缺乏，並且其功能仍未得到確認。
發明內容
專利目的
《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》提供一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，其可編碼一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶蛋白，所述蛋白具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性，該基因的套用可用於提高瓊膠、蔗糖、纖維素、半纖維素、海藻糖、果膠質、胼胝質以及糖脂、糖蛋白等含量。
《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的目的之一在於提供一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，所述基因是從海帶（Saccharina japonica）中分離出來的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，命名為SjUGP；所述基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO：1所示。
《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的目的之二在於提供一種所述基因編碼的蛋白，所述蛋白由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列編碼，其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示；其具有可逆催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性。
《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》目的之三是所述基因及其編碼蛋白在合成瓊膠、澱粉、纖維素、海藻糖、蔗糖中的套用。
《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》目的之四是所述基因及其編碼蛋白在改良經濟成分性狀以及在進行發酵工程中的套用。
技術方案
《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》通過基因克隆的方法，從海帶中克隆到了一個尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，並通過實驗證明了其編碼的蛋白具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性，是合成瓊膠、澱粉、纖維素、海藻糖、蔗糖的關鍵基因。克隆和分析海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因有助於深入理解海帶等褐藻澱粉、纖維素、海藻糖、蔗糖合成機制，同時也會為相關產物基因工程和分子育種提供了基因資源。《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》首次從海帶（Saccharina japonica）中分離到尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因，並通過原核表達載體對重組蛋白進行酶活性檢測，證實了其具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的活性功能，具有澱粉、纖維素、海藻糖、蔗糖基因工程和分子育種的套用價值。
附圖說明
圖1為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因cDNA全長的PCR擴增圖。
圖2為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因及其編碼胺基酸序列（方框中分別為起始密碼子和終止密碼子）。
圖3為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因轉化pET32a載體後PCR檢測陽性克隆PCR擴增圖（1泳道為pET32a用EcoRI和NotI雙酶切產物；2泳道為SjUGP基因轉化pET32a載體用EcoRI和NotI雙酶切產物；M為DNA標準分子量）。
圖4為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產物純化後SDS-PAGE檢測圖。
圖5為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產物的Western-Blot檢測圖。
圖6為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產物的不同溫度對酶活性的檢測圖。
圖7為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產物的pH對酶活性的檢測圖。
圖8為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產物的不同金屬離子對酶活性的檢測圖。
圖9為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產物的不同底物濃度酶活性變化圖。
圖10為《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》的SjUGP基因轉化大腸桿菌BL21表達產物的不同底物濃度雙倒數曲線圖。
技術領域
《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》涉及一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。特別涉及一種海帶（Saccharina japonica）尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的核苷酸序列，及其編碼蛋白以及在合成澱粉、纖維素、海藻糖、蔗糖等的能力和在改良重要經濟成分和抗逆性狀中的套用。
權利要求
1.一種編碼海帶中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因，其特徵在於，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一種由權利要求1所述基因編碼的蛋白，其特徵在於，所述蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其具有催化UDP-葡萄糖和焦磷酸形成葡萄糖-1-磷酸和UTP的功能。
3.權利要求1所述的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其編碼蛋白在合成瓊膠、澱粉、纖維素、海藻糖、蔗糖等中的套用，以及在該成分對生物性狀改良中的套用。
4.權利要求1所述的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其編碼蛋白在改良經濟成分性狀以及在進行發酵工程中的套用。
實施方式
下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，分子克隆實驗指南（Sambrook J,et al.2008.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.）中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1：基因全長編碼區的克隆與分析
海帶採集自山東省榮成市，採集時間為2011年7月。採用Trizol法提取海帶雌配子體總RNA，使用TAKARA公司PrimeScript II 1 Strand cDNA Synthesis試劑盒以海帶配子體總RNA反轉錄的第一鏈cDNA為模板，採用Touchdown PCR技術進行海帶SjUGP基因的CDS全長序列的擴增，擴增引物包括2組（5′-CAGCGGATCCATGTCTAGTGTCAGCATGAACGCGG-3′和5′-ATTAGCGGCCGCCGCACCCTCAGCCGA-3′；5′-CAGCGGATCCATGTCTAGTGTCAGCATGAACGCGG-3′和5′-ATTAGCGGCCGCCGCACCCTCAGCCGA-3′）。PCR擴增程式為：94℃ 3分鐘；94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 2分鐘，15個循環，每個循環退火溫度降低1℃；94℃ 30秒，45℃ 30秒，72℃ 2分鐘，20個循環；72℃ 10分鐘。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測後，在紫外燈下切割含有目的條帶的膠塊，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，於-20℃保存。回收的目的片段，於16℃金屬浴過夜連線至克隆載體pMD19-T，並轉化到大腸桿菌感受態細胞E.coli Top10中，塗布於含有100毫克/毫升 Amp的LB固體培養基上，37℃過夜培養，經過IPTG/X-gal藍白斑篩選後，挑取4-10個陽性克隆進行測序。將測序結果通過序列比對，分離到了一個海帶UGP基因，命名為SjUGP。SjUGP CDS序列全長為1446bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，編碼482個胺基酸，以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子。
實施例2：SjUGP編碼蛋白的製備及分析
海帶SjUGP PCR產物經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測後，在紫外燈下切下目的條帶，瓊脂糖凝膠回收，回收產物SjUGP和pET32a質粒進行EcoRI和NotI雙酶切，在37℃金屬浴3-4小時後，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。將目的片段SjUGP和質粒pET32a進行連線，16℃過夜，構建好的重組質粒命名為pET32a-SjUGP。
將重組質粒轉化大腸桿菌表達菌株BL21，挑取BL21陽性克隆，搖菌並保存菌株。PCR檢測重組子。PCR產物於1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，自動凝膠圖像分析儀成像。挑取電泳檢測插入條帶正確的克隆測序，檢測有無突變，移碼框是否改變。
將成功連線了目的片段的BL21菌株，以按照1:1000比例（10毫升 LB液體培養基+10微升 AP+10微升菌液）搖菌培養，每隔一個小時測OD值，直到OD600納米值達到0.6（3-4小時）。用0.1毫米的IPTG濃度誘導菌液，誘導條件為25℃，160轉，誘導6-8小時。誘導結束後取2毫升菌液4℃ 12000轉 5分鐘離心，棄上清，將管倒置於吸水紙上；沉澱加入1/2體積提前預冷好的1×PBS（ pH=7.5）中（即2毫升離心後的沉澱中加入1毫升 1×PBS），充分混勻。超聲法破碎菌液，收集破碎後的上清液，用0.45微米的濾膜過濾，Ni柱純化後，收集的蛋白樣品放入透析袋中透析，以除去不需要的離子，獲得重組SjUGP蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，採用SDS-PAGE、Western-Blot檢測重組蛋白的表達。
實施例3：SjUGP編碼蛋白的功能驗證
UGP酶活測定：反應體系如下：100毫米 1×PBS,0.85毫米 UDPG,0.5毫米 PPi,5毫米 Mgcl2,0.3毫米 NADP,5unit PGM,5unit GDH和適量實施例2製備的重組SjUGP蛋白，總的反應體系為1毫升，加入底物M-6-P起始反應。將上述除去底物的體系混合後在相應溫度條件下孵育2分鐘後起始反應，以相應的緩衝液為空白對照，在340納米處分別測定反應0分鐘、6分鐘和12分鐘吸光值的變化，每個反應設定4個平行樣。經檢測，酶活為373.38U/g，對UDPG的Km為4.33微摩爾，最適反應溫度為37℃，最適pH為8.0。該酶為高溫酶，鹼性蛋白；Mg、Zn、Mn和Ca可以促進酶活，Pb、Cu抑制其活性。
2014年前UGP酶相關的基因及蛋白在一些植物和細菌中得到了檢測，例如細菌Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus（參見非專利文獻：Ma Z,Fan HJ,Lu CP.Molecular cloning and analysis of the UDP-Glucose Pyrophosphorylase in Streptococcus equi subsp.zooepidemicus.Mol Biol Rep.2011 Apr;38（4）:2751-60.），細菌Sphingomonas paucimobilis（參見非專利文獻：Marques AR,Ferreira PB,Sá-Correia I,Fialho AM.Characterization of the ugpG gene encoding a UDP-glucose pyrophosphorylase from the gellan gum producer Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461.Mol Genet Genomics.2003 Mar;268（6）:816-24.），細菌Mycobacterium tuberculosis（參見非專利文獻：Lai X,Wu J,Chen S,Zhang X,Wang H.Expression,purification,and characterization of a functionally active Mycobacterium tuberculosis UDP-glucose pyrophosphorylase.Protein Expr Purif.2008 Sep;61（1）:50-6.），植物大麥（barley）（參見非專利文獻：Decker D,Meng M,Gornicka A,Hofer A,Wilczynska M,Kleczkowski LA.Substrate kinetics and substrate effects on the quaternary structure of barley UDP-glucose pyrophosphorylase.Phytochemistry.2012 Jul;79:39-45.）；但其各自的酶活性都遠遠小於該研究分析的海帶UGP基因，上述幾種UGP酶與《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》製備的UGP酶的Km值對比如下：
來源 | Km 值（微摩爾） |
《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》實施例3 | 4.33 |
細菌Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus | 8.5 |
細菌Sphingomonaspaucimobilis | 7.5 |
細菌Mycobacteriumtuberculosis | 11.87 |
大麥（barley） | 250 |
榮譽表彰
2020年7月14日，《一種海帶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。
