《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》是天津市康婷生物工程有限公司於2010年2月2日申請的專利，該專利的申請號為2010103010647，公布號為CN101864471A，授權公布日為2010年10月20日，發明人是劉小兵。
《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》的步驟包括（1）搖瓶種子液、（2）種子罐種子液、（3）發酵培養得到發酵液，還包括以下步驟：（4）發酵液的萃取提純：將發酵液用乙醇沉澱後，再次溶解得溶解液，經二次板框過濾至澄清，再進行三次過濾得澄清液，再用乙醇噴淋澄清液，得噴淋沉澱物；（5）乾燥制粉：將上述步驟得到的全部沉澱物經無水乙醇脫水後，用乳化泵進行乳化制粉，得粉狀沉澱，進一步用無水乙醇脫水後，50-60℃真空乾燥後，即得透明質酸。該發明採用複合誘變技術篩選出莢膜大，透明質酸產率高，不產透明質酸酶的菌種的生產菌種，該菌種對發酵原料適應性強，透明質酸產品產率高，可達到6-7克/升，其回收率高達92％，其發酵時間僅為24-26小時，有效節省能耗。
2016年12月7日，《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種微生物發酵法生產透明質酸的方法
- 公布號：CN101864471A
- 授權日：2010年10月20日
- 申請號：2010103010647
- 申請日：2010年2月2日
- 申請人：天津市康婷生物工程有限公司
- 地址：天津市西青經濟開發區建福路5號
- 發明人：劉小兵
- Int.Cl.：C12P19/04(2006.01)I；C08B37/08(2006.01)I；C12R1/46(2006.01)N
- 代理機構：天津盛理智慧財產權代理有限公司
- 代理人：王來佳
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
透明質酸分子具有良好的保濕性和黏彈性，因而套用於各種化妝品、保健品眼科手術、關節注射、促進創傷癒合、調節血管壁的通透性、醫用整形材料和保健品等方面，21世紀90年代中期以來，國際市場透明質酸銷量逐漸上升，2010年2月前全球藥用透明質酸總銷售額為4.2-5.5億美元，到2010年肯定會超過10億美元。中國國內研究水平低下，生產能力僅為10噸，遠遠不能滿足市場的需求。
截至2010年2月，中國國內大部分微生物發酵法生產透明質酸的企業採用的工藝發酵周期長，一般在36-40左右，產物分子量低，產品透光率差（一般在90％左右），蛋白質含量高，其成品葡萄糖醛酸含量一般為35-38％，部分廠家透明質酸產品形態為纖維狀，此種透明質酸溶解困難，一般要2天左右，且收率低於75％，為了滿足中國國內不斷擴大的需求市場，透明質酸的生產工藝亟待改善。
發明內容
專利目的
《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》的目的在於克服2010年2月前技術的不足，提供一種發酵周期短、產品溶解性高、成本低的微生物發酵法生產透明質酸的方法。
技術方案
《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》步驟包括（1）搖瓶種子液、（2）種子罐種子液、（3）發酵培養得到發酵液，還包括以下步驟：
（4）發酵液的萃取提純：將發酵液經板框過濾後得濾液，加入2-4倍的乙醇溶液沉澱，收集沉澱物，加入與濾液等體積的NaCl溶液攪拌溶解，進行二次板框過濾至澄清，得到二次澄清液，將二次澄清液經0.3-0.5微米的濾膜或濾板過濾後，加入乙酸調節pH至4.0-5.0，得到酸處理後的三次澄清液，再用乙醇溶液噴淋三次澄清液，再進行沉澱，得到沉澱物；
（5）乾燥制粉：將上述步驟得到的全部沉澱物經無水乙醇脫水後，用乳化泵進行乳化制粉，得粉狀沉澱，進一步用無水乙醇脫水後，50-60℃真空乾燥後，含水控制在10％以下，即得透明質酸。
而且，所述板框過濾使用的硅藻土的型號為821號和616號。
而且，所述821號和616號硅藻土的重量比例為1:1-5。
而且，所述乙醇溶液的濃度為：95％（v/v）。
而且，所述NaCl溶液的濃度為：0.1摩爾/升。
改善效果
1、《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》採用複合誘變技術篩選出莢膜大，透明質酸產率高，不產透明質酸酶的菌種的生產菌種，該菌種對發酵原料適應性強，透明質酸產品產率高，可達到6-7克/升，其回收率高達92％，其發酵時間僅為24-26小時，有效節省能耗。
2、該發明採用獨創的噴淋制粉技術，使產品結構形態更加細膩，使用性能更加優越，溶解性更好，其透光率達到99％。
3、該發明產品的提純過程採用板框過濾和微孔濾板過濾技術，替代活性炭吸附和CPC吸附等複雜過程，使生產操作更加簡便。
4、該發明採用酸化乙醇噴淋制粉技術，製成的產品為粉末狀，比絮狀易於溶解。
5、該發明能夠將透明質酸開發成食品級、化妝品級以及醫用級產品。
技術領域
《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》屬於微生物發酵領域，尤其是一種微生物發酵法生產透明質酸的方法。
權利要求
1.《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》步驟包括（1）搖瓶種子液、（2）種子罐種子液、（3）發酵培養得到發酵液，其特徵在於：還包括以下步驟：（4）發酵液的萃取提純：將發酵液經板框過濾後得濾液，加入2-4倍的乙醇溶液沉澱，收集沉澱物，加入與濾液等體積的NaCl溶液攪拌溶解，進行二次板框過濾至澄清，得到二次澄清液，將二次澄清液經0.3-0.5微米的濾膜或濾板過濾後，加入乙酸調節pH至4.0-5.0，得到酸處理後的三次澄清液，再用乙醇溶液噴淋三次澄清液，再進行沉澱，得到沉澱物；（5）乾燥制粉：將上述步驟得到的全部沉澱物經無水乙醇脫水後，用乳化泵進行乳化制粉，得粉狀沉澱，進一步用無水乙醇脫水後，50-60℃真空乾燥後，含水控制在10％以下，即得透明質酸。
2.根據權利要求1所述的一種微生物發酵法生產透明質酸的方法，其特徵在於：所述板框過濾使用的硅藻土的型號為821號和616號。
3.根據權利要求2所述的一種微生物發酵法生產透明質酸的方法，其特徵在於：所述821號和616號硅藻土的重量比例為1:1-5。
4.根據權利要求1所述的一種微生物發酵法生產透明質酸的方法，其特徵在於：所述乙醇溶液的濃度為：95％（v/v）。
5.根據權利要求1所述的一種微生物發酵法生產透明質酸的方法，其特徵在於：所述NaCl溶液的濃度為：0.1摩爾/升。
實施方式
《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》使用的發酵菌種屬於外來菌種，菌種分類是獸疫鏈球菌。
《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》工藝過程如下：
（1）搖瓶種子液：將斜面菌種接種於裝有滅菌培養液400毫升的1升錐形瓶中，37℃培養12-16小時，光鏡觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種於種子罐中；
（2）種子罐種子液：按搖瓶種子液的配方配製培養液60升，加入種子罐中，通蒸汽加熱，121℃滅菌30分鐘，冷卻至37℃，用火焰法接種，將搖瓶種子液接種於種子罐中，通氣量60升/分鐘，攪拌轉速120-140/分鐘，37℃培養12-16小時，光鏡觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種於發酵罐中；
（3）發酵培養：按種子罐的配方，把糖的用量提高到6％，配製培養液600升，加入1噸的發酵罐中，通蒸汽加熱，121℃滅菌30分鐘，冷卻至37℃，將種子液通過移種管道接種於發酵罐中，維持通氣量400-600升/分鐘，攪拌轉速140-160/分鐘，37℃培養24-26小時，發酵過程中，糖的濃度下降至0.5％以下，PH下降很慢或不再下降時，即為發酵終點，得到含有透明質酸發酵液；（以上3個步驟在馬朝梅（廣西柳州化學工業集團有限公司），發酵法生產透明質酸工藝研究，廣西工學院學報，2007，18（3）：8-12中有報導，屬於2010年2月前技術，《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》申請就不再更加詳細描述），《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》申請還包括：
（4）發酵液的萃取提純：將發酵液經板框過濾後得濾液，加入3倍的95％乙醇沉澱，收集沉澱物，加入與濾液等體積的0.1摩爾/升的NaCl溶液攪拌溶解，進行二次板框過濾至澄清，得到二次澄清液；將二次澄清液經0.45微米的濾膜或濾板過濾後，加入乙酸調節pH至4.0-5.0，得到酸處理後的三次澄清液，再用95％乙醇噴淋三次澄清液，再進行沉澱，得到沉澱物；
板框過濾的硅藻土的型號為821號和616號，將兩種硅藻土按比例混合，得到後裝入板框進行過濾，821號和616號硅藻土的重量比例為1:1-5。
（5）乾燥制粉：將得到的全部沉澱物經無水乙醇脫水後，用乳化泵進行乳化制粉，得粉狀沉澱，進一步用無水乙醇脫水後，50-60℃真空乾燥後，含水控制在10％以下，即得透明質酸。
經《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》得到的透明質酸產品產率高，可達到6-7克/升，其回收率為92％。
產品性能指標：
性狀：白色粉末或細小顆粒；氣味：無臭無味；pH（1克/升）：6.5-7.0；澄清度（1克/升）：透光率＞99％；乾燥失重：＜10％；分子量：＞1.8×106；蛋白質：＜0.05％；葡萄糖醛酸：≥44％；鉛：＜20毫克/千克；砷：＜2毫克/千克；細菌總數：＜10個/克；糞大腸菌群：不得檢出；金黃色葡萄球菌：不得檢出；綠膿桿菌：不得檢出。
榮譽表彰
2016年12月7日，《一種微生物發酵法生產透明質酸的方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。
