《一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法》是江南大學於2013年1月30日申請的專利，該專利申請號為2013100367675，公布號為CN103103275A，公布日為2013年5月15日，發明人是胥傳來、嚴文靜、匡華、王利兵、徐麗廣、馬偉。
一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法，屬於納米生物技術領域。該發明包括：不同尺寸金納米粒子的合成、金納米粒子修飾輔助DNA、手性四面體的組裝以及目標DNA手性感測器的構建。該發明提供了一種利用金納米粒子-DNA複合物構建的手性四面體，通過目標DNA與大尺寸金納米粒子上的DNA雜互動補，組裝結構從空間四面體變為三聚體，通過圓二色譜法信號的變化對目標DNA濃度進行檢測，目標DNA的檢測限為0.97飛摩爾/升，線性範圍在5飛摩爾/升-1000飛摩爾/升。該發明方法能特異性地對目標DNA進行快速、超靈敏檢測，為痕量DNA的檢測提供了一種有效的方法。
2021年6月24日，《一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法》獲得第二十二屆中國專利銀獎。
（概述圖為《一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法
- 公布號：CN103103275A
- 申請人：江南大學
- 發明人：胥傳來、嚴文靜、匡華、王利兵、徐麗廣、馬偉
- 申請號：2013100367675
- 申請日：2013年1月30日
- 公布日：2013年5月15日
- 地址：江蘇省無錫市濱湖區蠡湖大道1800號江南大學
- 代理機構：無錫市大為專利商標事務所
- 代理人：時旭丹、劉品超
- Int. Cl.：C12Q1/68(2006.01)I
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,專利榮譽,
專利背景
手性也稱圓二色性，是一種識別分子構象的特殊吸收光譜。當一束平面偏振光通過光學活性物質時，由於左右圓偏振光的折射率不同，偏振面將旋轉一定的角度，這種現象稱為旋光。若光學活性物質含有生色團對左、右圓偏振光的吸收能力也不同，則造成通過的左、右圓偏振光不僅速度不同，而且振幅也不一樣。因此，疊加產生的偏振光將不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，這種現象稱為圓二色性。
手性分子是化學結構上鏡像對稱而又不能完全重合的分子，一個化合物的分子與其鏡像不能互相疊合，則必然存在一個與鏡像相應的化合物，這兩個化合物之間的關係，相當於左手和右手的關係，即互相對映。這種互相對應的兩個化合物成為對映異構體。這類化合物分子稱為手性分子，它是一切生命的起源。
納米技術被認為是對21世紀一系列高新技術的產生和發展有極為重要影響的一門熱點學科。所謂納米技術，是指用數千個分子或原子製造新型材料或微型器件的科學技術。其中納米材料是整個納米技術發展的基礎。納米材料廣義上是三維空間中至少有一維處於納米尺度範圍或者由該尺度範圍的物質為基本結構單元所構成的材料的總稱。由於納米尺寸的物質具有與巨觀物質所迥異的表面效應、小尺寸效應、巨觀量子隧道效應和量子限域效應，因而納米材料具有異於普通材料的光、電、磁、熱、力學、機械等性能。納米技術的快速發展為手性研究提供了更大的發展空間，手性與納米材料的結合起來，創建了手性納米材料的新型研究領域。
發明內容
專利目的
《一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法》的目的是提供一種基於手性四面體的構象改變，快速、簡單、超靈敏的檢測DNA的方法。
技術方案
《一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法》的技術方案：一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法，包括不同尺寸金納米粒子的合成、金納米粒子修飾輔助DNA、手性四面體的組裝以及目標DNA手性感測器的構建。
檢測的目標DNA為：5’-GGC GAA CTG GTC CCG TCT ACT TAC CGA AAC GCG CAC CTG AGA CCT TCT AAT AGG GAA AGC CGT AAT GTG CAT GTA TCT CCA GGC AAA-3’。工藝步驟為：
（1）30納米（Au1）金納米粒子的合成：30納米金納米粒子用檸檬酸三納沸水中還原氯金酸法合成；
（2）10納米（Au2）金納米粒子的合成：10納米金納米粒子採用兩步法合成；
（3）鉀鹽包裹金納米粒子：步驟（1）合成的30納米（Au1）金納米粒子及步驟（2）合成的10納米（Au2）金納米粒子分別用二水合雙(對-磺醯苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液進行包裹使得在0.1-0.5摩爾/升濃度NaCl溶液中穩定存在，從而提高DNA的組裝效率；
（4）金納米粒子和輔助DNA偶聯：所用的輔助DNA共有四種：DNA1，DNA2，DNA3，DNA4；DNA1為與待測濃度的目標DNA完全互補，DNA2，DNA3，DNA4為依據目標DNA而專門設計；
DNA1：5’-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC-3’；
DNA2：5’-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’；
DNA3：5’-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’；
DNA4：5’-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’；
將步驟（3）包裹的30納米（Au1）和10納米（Au2）的金納米粒子通過巰基與輔助DNA進行偶聯，所用的輔助DNA共有四種（DNA1，DNA2，DNA3，DNA4），形成四種不同的金納米粒子-DNA複合物（Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）；
（5）手性四面體結構的組裝：將步驟（4）組裝的四種金納米粒子-DNA複合物等摩爾濃度混合，形成手性四面體結構，並對此結構進行表征。
（6）手性四面體檢測目標DNA。
所述的基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法，步驟為：
（1）30納米（Au1）金納米粒子的合成：30納米（Au1）金納米粒子的合成方法為：潔淨的三口燒瓶中加入47.5毫升超純水，再加入2.5毫升質量濃度0.2%氯金酸溶液，攪拌並加熱至沸騰，7-8分鐘後快速加入0.75毫升質量濃度1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變為紅色後，停止加熱，繼續攪拌15分鐘；透射電鏡顯示平均粒徑為30納米；
（2）10納米（Au2）金納米粒子的合成：10納米（Au2）金納米粒子的合成方法為：潔淨的三口燒瓶中加入79毫升超純水和1毫升質量濃度1%氯金酸作為A液；另取一潔淨的小瓶子，加入4毫升質量濃度1%檸檬酸三鈉，0.1毫升質量濃度1%單寧酸，0.1毫升25毫摩爾/升碳酸鉀，15.8毫升超純水作為B液。A、B液均加熱到60攝氏度，然後在高速攪拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60攝氏度下繼續攪拌30分鐘到形成深紅色溶液。然後將溶液加熱回流2分鐘形成亮紅色溶液。最後冷卻到室溫形成檸檬酸穩定的金納米粒子，透射電鏡顯示平均粒徑為10納米。
（3）鉀鹽包裹金納米粒子：分別取步驟（1）製備的30納米（Au1）金納米粒子及步驟（2）製備的10納米（Au2）金納米粒子各自取10毫升50納摩爾/升分別置於甲瓶及乙瓶中，甲瓶加入5微升10毫克/毫升及乙瓶加入5微升20毫克/毫升的二水合雙(對-磺醯苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液，室溫震盪反應10小時；各自用6000轉/分鐘及13000轉/分鐘，離心10分鐘後去除上清液，加水恢復到原體積；
（4）金納米粒子和輔助DNA偶聯：步驟（3）製備的鉀鹽包裹的兩種金納米粒子（Au1及Au2），分別取一份50微升30納摩爾/升金納米粒子（Au1）於1號PCR管中，分別取三份50微升10納摩爾/升金納米粒子（Au2）於2，3及4號PCR管中，向4個管中依序各自加入1微升10微摩爾/升的DNA1，DNA2，DNA3及DNA4，混勻後，向各體系中加入5微升5×tris-硼酸緩衝液和1.25微升1摩爾/升NaCl溶液，室溫振搖反應2小時；Au1-DNA1用6000轉/分鐘離心10分鐘，Au2-DNA2，Au2-DNA3及Au2-DNA4用13000轉/分鐘離心10分鐘，去除上清液，沉澱加水稀釋至原體積5倍；
（5）手性四面體結構的組裝：步驟（4）製備的四種金納米粒子-DNA的複合物（Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）各取40微升混合於PCR管中，加入4微升1摩爾/升NaCl溶液，室溫反應過夜，形成手性四面體結構。這種手性四面體結構，因為引入了大尺寸、非球形的金納米粒子，增加了結構的不對稱性，所以在523納米處有很強的圓二色信號。
（6）手性四面體檢測目標DNA：在步驟（5）的製備過程中加入與DNA1完全互補的目標DNA，此時，目標DNA會與Au1-DNA1互補雜交，其他三種金納米粒子-DNA複合物（Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）組裝形成10納米金的三聚體結構，此時手性四面體在523納米處的特徵圓二色信號發生減弱。根據523納米處圓二色信號的比值與目標DNA的濃度建立標準曲線。該實驗中，DNA的檢測限為0.97飛摩爾/升，線性範圍在5飛摩爾/升-1000飛摩爾/升。
註：該發明所使用的DNA均購自中國上海生工生物工程有限公司，並通過聚丙烯醯胺凝膠電泳進行純化。
表1 DNA的編號、序列及長度
改善效果
《一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法》的有益效果：該發明製備了一種通過改變手性自組裝四面體的構型，利用圓二色信號簡單、快速、超靈敏地檢測DNA的方法。為轉基因產品今後的生產、監管提供了方便，可滿足中國國內對其生產、監管的需要。
附圖說明
圖1：手性四面體組裝結構的透射電鏡圖；
圖2：加入目標DNA後的納米材料組裝結構透射電鏡圖；
圖3：手性四面體中加入不同濃度目標DNA後的圓二色變化曲線圖；沿著箭頭的方向，DNA濃度依次為0皮摩爾/升，0.005皮摩爾/升，0.01皮摩爾/升，0.05皮摩爾/升，0.1皮摩爾/升，0.5皮摩爾/升，1.0皮摩爾/升，5皮摩爾/升；
圖4：目標DNA檢測的標準曲線圖。
技術領域
《一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法》屬於納米生物技術領域。
權利要求
1、一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法，其特徵在於：包括不同尺寸金納米粒子的合成、金納米粒子修飾輔助DNA、手性四面體的組裝以及目標DNA手性感測器的構建；
檢測的目標DNA為：5’-GGC GAA CTG GTC CCG TCT ACT TAC CGA AAC GCG CAC CTG AGA CCT TCT AAT AGG GAA AGC CGT AAT GTG CAT GTA TCT CCA GGC AAA-3’；
步驟為：
（1）30納米金納米粒子Au1的合成：30納米金納米粒子用檸檬酸三納沸水中還原氯金酸法合成；
（2）10納米金納米粒子Au2的合成：10納米金納米粒子採用兩步法合成；
（3）鉀鹽包裹金納米粒子：步驟（1）合成的30納米金納米粒子Au1及步驟（2）合成的10納米金納米粒子Au2分別用二水合雙(對-磺醯苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液進行包裹使得在0.1-0.5摩爾/升濃度NaCl溶液中穩定存在，從而提高DNA的組裝效率；
（4）金納米粒子和輔助DNA偶聯：所用的輔助DNA共有四種：DNA1，DNA2，DNA3，DNA4；DNA1為與待測濃度的目標DNA完全互補，DNA2，DNA3，DNA4為依據目標DNA而專門設計；
DNA1：5’-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC-3’；
DNA2：5’-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’；
DNA3：5’-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’；
DNA4：5’-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’；
將步驟（3）鉀鹽包裹的Au1和Au2通過巰基與輔助DNA進行偶聯，形成四種不同的金納米粒子-DNA複合物：Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4；
（5）手性四面體結構的組裝：將步驟（4）組裝的四種金納米粒子-DNA複合物等摩爾濃度混合，組裝手性四面體結構，並對此結構進行表征；
（6）利用圓二色信號對手性四面體檢測目標DNA。
2、根據權利要求1所述的基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法，其特徵在於：
（1）30納米金納米粒子Au1的合成：30納米金納米粒子Au1的合成方法為：潔淨的三口燒瓶中加入47.5毫升超純水，再加入2.5毫升0.2%氯金酸溶液，攪拌並加熱至沸騰，7-8分鐘後快速加入0.75毫升1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變為紅色後，停止加熱，繼續攪拌15分鐘；透射電鏡顯示平均粒徑為30納米；
（2）10納米金納米粒子Au2的合成10納米金納米粒子Au2的合成方法為：潔淨的三口燒瓶中加入79毫升超純水和1毫升1%氯金酸作為A液；另取一潔淨的小瓶子，加入4毫升1%檸檬酸三鈉，0.1毫升1%單寧酸，0.1毫升25毫摩爾/升碳酸鉀，15.8毫升超純水作為B液；A、B液均加熱到60攝氏度，然後在高速攪拌下將B液迅速加入A液中，混合液在60攝氏度下繼續攪拌30分鐘到形成深紅色溶液，然後將溶液加熱回流2分鐘形成亮紅色溶液，最後冷卻到室溫形成檸檬酸穩定的金納米粒子，透射電鏡顯示平均粒徑為10納米；
（3）鉀鹽包裹金納米粒子：分別取步驟（1）製備的30納米金納米粒子Au1及步驟（2）製備的10納米金納米粒子Au2各自取10毫升50納摩爾/升分別置於甲瓶及乙瓶中，甲瓶加入5微升10毫克/毫升及乙瓶加入5微升20毫克/毫升的二水合雙(對-磺醯苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液，室溫震盪反應10小時；各自用6000轉/分鐘及13000轉/分鐘，離心10分鐘後去除上清液，加水恢復到原體積；
（4）金納米粒子和輔助DNA偶聯：步驟（3）製備的鉀鹽包裹的兩種金納米粒子Au1及Au2，分別取一份50微升30納摩爾/升金納米粒子Au1於1號PCR管中，分別取三份50微升10納摩爾/升金納米粒子Au2於2，3及4號PCR管中，向4個管中依序各自加入1微升10微摩爾/升的DNA1，DNA2，DNA3及DNA4，混勻後，向各體系中加入5微升5×tris-硼酸緩衝液和1.25微升1摩爾/升NaCl溶液，室溫振搖反應2小時；Au1-DNA1用6000轉/分鐘離心10分鐘，Au2-DNA2，Au2-DNA3及Au2-DNA4用13000轉/分鐘離心10分鐘，去除上清液，沉澱加水稀釋至原體積5倍；
（5）手性四面體結構的組裝：步驟（4）製備的四種金納米粒子-DNA的複合物：Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4，各取40微升混合於PCR管中，加入4微升1摩爾/升NaCl溶液，室溫反應過夜，形成手性四面體結構，這種手性四面體結構，因為引入了大尺寸、非球形的金納米粒子，增加了結構的不對稱性，所以在523納米處有很強的圓二色信號；
（6）利用圓二色信號對手性四面體檢測目標DNA：在步驟（5）的製備過程中加入與DNA1完全互補的目標DNA，此時，目標DNA會與Au1-DNA1互補雜交，其他三種金納米粒子-DNA複合物Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4組裝形成10納米金的三聚體結構，此時手性四面體在523納米處的特徵圓二色信號發生減弱；根據523納米處圓二色信號的比值與目標DNA的濃度建立標準曲線。
實施方式
實施例1
（1）30納米（Au1）金納米粒子的合成
30納米（Au1）金納米粒子的合成方法為：潔淨的三口燒瓶中加入47.5毫升超純水，再加入2.5毫升0.2%氯金酸溶液，攪拌並加熱至沸騰，7-8分鐘後快速加入0.75毫升1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變為紅色後，停止加熱，繼續攪拌15分鐘；透射電鏡顯示平均粒徑為30納米；
（2）10納米（Au2）金納米粒子的合成
10納米（Au2）金納米粒子的合成方法為：潔淨的三口燒瓶中加入79毫升超純水和1毫升1%氯金酸作為A液；另取一潔淨的小瓶子，加入4毫升1%檸檬酸三鈉，0.1毫升1%單寧酸，0.1毫升25毫摩爾/升碳酸鉀，15.8毫升超純水作為B液。A、B液均加熱到60攝氏度，然後在高速攪拌下將B液迅速加入A液中，混合液在60攝氏度下繼續攪拌30分鐘到形成深紅色溶液。然後將溶液加熱回流2分鐘形成亮紅色溶液。最後冷卻到室溫形成檸檬酸穩定的金納米粒子，透射電鏡顯示平均粒徑為10納米。
（3）鉀鹽包裹金納米粒子
步驟（1）製備的30納米（Au1）金納米粒子以及步驟（2）製備的10納米（Au2）金納米粒子各取10毫升50納摩爾/升，各自加入5微升10毫克/毫升及5微升20毫克/毫升二水合雙(對-磺醯苯基)苯基膦化二鉀鹽溶液，室溫震盪反應10小時；各自用6000轉/分鐘及13000轉/分鐘，離心10分鐘後去除上清液，加水恢復到原體積；
（4）金納米粒子和輔助DNA偶聯
步驟（3）製備的鉀鹽包裹的兩種金納米粒子（Au1及Au2），分別取一份50微升30納摩爾/升金納米粒子（Au1）於1號PCR管中，分別取三份50微升10納摩爾/升金納米粒子（Au2）於2，3及4號PCR管中，向4個管中依次加入1微升10微摩爾/升的DNA1，DNA2，DNA3及DNA4，混勻後，向各體系中加入5微升5×tris-硼酸緩衝液和1.25微升1摩爾/升NaCl溶液，室溫振搖反應2小時；Au1-DNA1用6000轉/分鐘離心10分鐘，Au2-DNA2，Au2-DNA3及Au2-DNA4用13000轉/分鐘離心10分鐘，去除上清液，沉澱加水稀釋至原體積5倍；
（5）手性四面體結構的組裝
步驟（4）製備的四種金納米粒子-DNA的複合物（Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）各取40微升混合於PCR管中，加入4微升1摩爾/升NaCl溶液，室溫反應過夜，形成手性四面體結構。這種手性四面體結構，因為引入了大尺寸、非球形的金納米粒子，增加了結構的不對稱性，所以在523納米處有很強的圓二色信號。
（6）手性四面體檢測目標DNA
在步驟（5）的製備過程中加入與DNA1完全互補的目標DNA，此時，目標DNA會與Au1-DNA1互補雜交，其他三種金納米粒子-DNA複合物（Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）組裝形成10納米金的三聚體結構，此時手性四面體在523納米處的特徵圓二色信號發生減弱。根據523納米處圓二色信號的比值與目標DNA的濃度建立標準曲線。該發明中，目標DNA的檢測限為0.97飛摩爾/升，線性範圍在5飛摩爾/升-1000飛摩爾/升。
組裝四面體結構的表征：
將上述組裝好的產品進行5000轉/分鐘離心10分鐘，棄上清，沉澱重分散到120微升的超純水中，超純水洗一次。電鏡表征：7微升的上述處理過的樣品滴加到碳膜支持的銅網上，在紅外燈下進行乾燥。投射電鏡採用JEOL JEM-2100型號的電鏡，其加速電壓為200千伏，如圖1和2所示。圓二色譜表征：取組裝好的體系100微升於比色皿中，用超純水做空白對照。圓二色譜儀採用法國Bio-LogicMOS-450+SMF-300，如圖3所示。
專利榮譽
2021年6月24日，《一種基於手性四面體構象改變對目標DNA濃度進行檢測的方法》獲得第二十二屆中國專利銀獎。
