一種卡介菌多糖核酸製備過程中的斜面培養新工藝

《一種卡介菌多糖核酸製備過程中的斜面培養新工藝》是吉林亞泰生物藥業股份有限公司於2013年11月15日申請的專利，該專利的公布號為CN103923851A，授權公布日為2014年7月16日，發明人是宮麗、趙柏松、張岩、宋水燕、孫寶華、朱曉宇、房麗君。該發明屬於生物製品生產技術領域。

《一種卡介菌多糖核酸製備過程中的斜面培養新工藝》其特徵在於：從源頭上控制馬鈴薯質量，選取荷蘭7號馬鈴薯為生產原材料，並將切好的馬鈴薯塊置於1%的NaHCO3溶液中浸泡30分鐘，用1%NaHCO3溶液浸泡後的馬鈴薯，起到固定澱粉作用，避免收集菌體時，將土豆混入其中，提高卡介菌多糖核酸的質量；從培養方式上，採用固體培養和浮膜培養結合的方式，採用30-35°斜面培養的方式，這種斜面培養新工藝大大提高了菌體的收穫率。使菌體收率從單管收率4克提高到6.5-7.0克。

2019年10月，《一種卡介菌多糖核酸製備過程中的斜面培養新工藝》獲得第三屆吉林省專利獎優秀獎。

基本介紹

• 中文名：一種卡介菌多糖核酸製備過程中的斜面培養新工藝
• 申請人：吉林亞泰生物藥業股份有限公司
• 申請日：2013年11月15日
• 申請號：2013105710731
• 公布號：CN103923851A
• 公布日：2014年7月16日
• 發明人：宮麗、趙柏松、張岩、宋水燕、孫寶華、朱曉宇、房麗君
• 地址：吉林省長春市經濟技術開發區仙台大街2686號
• Int.Cl.：C12N1/20(2006.01)I、C12R1/32(2006.01)N
• 類別：發明專利

專利背景

卡介菌多糖核酸是一種有效的新型免疫調節劑。研究表明，卡介菌多糖核酸通過調節機體內的細胞免疫、體液免疫、刺激網狀內皮系統，激活單核-巨噬細胞功能，增強自然殺傷細胞功能來增強機體抗病能力；通過穩定肥大細胞，封閉IgE功能，減少脫顆粒細胞釋放活性物質，以及具有抗乙醯膽鹼所致的支氣管痙攣作用，達到抗過敏及平喘作用。通過卡介菌多糖核酸對T細胞致敏，產生細胞介導的傳染免疫，致敏T淋巴細胞在抗原的特異性刺激下分化，增值併合成，釋放一系列淋巴因子，從而發揮細胞免疫功能，引起特異性抗體生成及對疣體的免疫排斥而抗病毒作用；還可以通過增強機體內巨噬細胞的自然毒效應和誘導干擾素的形成。

2013年11月之前的卡介菌多糖核酸原粉製備全過程是培養基製備、接種、培養、收菌、破菌、提取、透析、精製和製備乾粉。其中培養這道工序，直接關係到原粉的收率和質量，是至關重要的。2013年前中國國內生產廠家一般採用原始的培養方法。2013年11月之前的卡介菌多糖核酸原粉製備過程中培養方法是：將馬鈴薯切成長約40毫米馬鈴薯段，將已配好的液體培養基加至菌種管，取備用的馬鈴薯塊，將馬鈴薯放入菌種管內，然後蓋好矽膠塞，經過接種，傳代，將接菌後的蘇通馬鈴薯培養基置於培養室內培養。卡介菌菌體收集、破菌、提取、精製獲得卡介菌多糖、核酸。原始的工藝由於從馬鈴薯的選種、培養的方式不科學，使菌體的單管收率很低，僅為4克左右。

發明內容

專利目的

《一種卡介菌多糖核酸製備過程中的斜面培養新工藝》提供了卡介菌多糖核酸原粉製備過程中培養工藝。

技術方案

《一種卡介菌多糖核酸製備過程中的斜面培養新工藝》從原料的選材上選用特殊種屬的荷蘭7號馬鈴薯，荷蘭7號馬鈴薯生產是從核心種薯繁育、種薯生產、質量檢測、病害防治、認證到倉儲、運輸的一系列完善、嚴謹的標準化模式，有完善的馬鈴薯生產體系和質量監督體系，從源頭上控制馬鈴薯質量；從培養方式上，我們採用30-35°斜面，固體培養和浮膜培養結合的培養方式，大大提高了菌體的收穫率，單管收率在6.5-7.0克。從原材料的選種到菌體的培養上的科學化，提高了卡介菌多糖核酸質量和收率。

改善效果

《一種卡介菌多糖核酸製備過程中的斜面培養新工藝》具有如下優點：

1、該發明的選材上選擇荷蘭7號馬鈴薯，提高了卡介菌多糖核酸的質量。

2、該發明選用固體和浮膜相結合的方式培養，大大提高了菌體收率。

3、該發明的斜面培養方式提高了菌體的收率，使菌體收率從單管收率4克提高到6.5-7.0克。

權利要求

1.在卡介菌多糖核酸製備過程中，包括:

（1）選取荷蘭7號馬鈴薯，用穿刺器刺成長約60毫米，直徑30毫米的土豆段，再用刀切成一側呈斜面30-35°的土豆塊；

（2）將切好的土豆塊置於1%NaHCO3溶液中浸泡30分鐘，然後棄去NaHCO3溶液，用純化水沖洗30分鐘；

（3）將液體培養基加至菌種管球形凹處，取備用的土豆塊，將土豆塊厚端一側朝下放入菌種管內，並使土豆約兩公分長度浸泡在培養液中，然後蓋好矽膠塞置於壓力蒸汽滅菌櫃中滅菌。溫度：121℃，壓力：0.12兆帕，時間：30分鐘；

（4）挑選在蘇通馬鈴薯培養基上生長飽滿、色淺黃、形狀乾皺成團、長勢良好的菌苔作為菌種，進行傳代。將接菌後的蘇通馬鈴薯培養基置於培養室內培養，菌種管放置與水平面呈30—35°角，成斜面培養，培養溫度：37±2℃；濕度：45-75%；培養時間：20～25天。

2.根據權利要求1卡介菌的一種培養方法，其特徵在於，土豆的選取為荷蘭7號馬鈴薯。

3.根據權利要求1卡介菌的一種培養方法，其特徵在於，切好的土豆塊置於溶液中浸泡30分鐘，其溶液為1%的NaHCO3。

4.根據權利要求1卡介菌的一種培養方法，其特徵在於，菌種管放置與水平面呈30—35°角，成斜面培養。

實施方式

• 實施例1

取新鮮無芽荷蘭7號馬鈴薯和由市場購得的普通土豆，分別標記為“試驗組一”和“試驗組二”，分別用模具切成長約60毫米、直徑30毫米的土豆段，再用刀切成一側呈斜面的土豆塊，將切好的土豆塊置於1%NaHCO3溶液中浸泡30分鐘，然後棄去NaHCO3溶液，用純化水沖洗30分鐘，加適量蘇通液體培養基加熱至70-75℃，恆溫20分鐘，棄去液體培養基，備用。

將已配好的液體培養基加至菌種管球形凹處，取備用的土豆塊，將土豆塊厚端一側朝下放入菌種管內，然後蓋好矽膠塞置於壓力蒸汽滅菌櫃中滅菌。溫度：121℃，壓力：0.12兆帕，滅菌時間：30分鐘。

兩組分別製得菌種管120支，進行傳代斜面培養。培養溫度：37±2℃；濕度：45-75%；培養時間：20天。

培養結束後剔出污染，混濁的菌種管，收集馬鈴薯培養基內表面培養物，兩組實驗隨機各取一百支菌種管，收集稱重對比，結果見表一。

• 實施例2

選取新鮮無芽荷蘭7號馬鈴薯，按實施例1方法製得菌種管240支，每120支菌種管作為一組，標記為“試驗組三”和“試驗組四”，從培養方式上，試驗組三我們採用30-35°斜面傾斜，實驗組四採用直立培養，經傳代培養後，兩組隨機各取100支菌種管集菌稱重對比，結果見表二。

表一

試驗組別	菌體總重量/克	單管菌體重量/克
試驗組一	658.2	6.58
試驗組二	618.9	6.19

從表中可見，選用荷蘭其馬鈴薯比普通的從市場購得馬鈴薯，菌體產量高。

表二

試驗組別	菌體總重量/克	單管菌體重量/克
試驗組三	652.1	6.52
試驗組四	415.8	4.16

從表二可知，傾斜培養比直立培養菌體產量提高很多。另外，用1%NaHCO3溶液中浸泡切好的土豆塊，起到固定澱粉作用，避免收集菌體時，將土豆混入其中。

實驗結果表明，卡介菌多糖核酸製備過程中採用的斜面培養新工藝，提高了卡介菌多糖核酸的質量和菌體的收率，通過不同選材和培養方式的對比實驗，可以看出選材上選擇荷蘭7號馬鈴薯，提高了卡介菌多糖核酸的質量。選用固體和浮膜相結合的方式培養，大大提高了菌體收率。使菌體收率從單管收率4克左右提高到6.5-7.0克。

榮譽表彰

2019年10月，《一種卡介菌多糖核酸製備過程中的斜面培養新工藝》獲得第三屆吉林省專利獎優秀獎。