一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》是國藥集團同濟堂（貴州）製藥有限公司於2013年02月20日申請的發明專利，該專利的公布號為：CN103083521A，專利公布日：2013年05月08日，該專利申請號為2013100550793，發明人是周寧，王曉春，姚新生，秦嶺，戴毅，王新巒，馮澤熹，張志強，孫宜春，曾香蘭，龐媛媛，王飛。

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》提供一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑。《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》提供了一種仙靈骨葆的提取方法，包括：（1）按重量份計稱取淫羊藿600-1500份、丹參50-150份、補骨脂50-150份、續斷80-200份、知母50-150份和地黃50-150份；（2）將斷續、丹參、補骨脂粉碎成細粉；淫羊藿、知母和地黃混合後經水提得到水提物，濃縮至稠膏，加入上述細粉，混勻，乾燥，得到仙靈骨葆原料粉；（3）取仙靈骨葆原料粉，以乙醇水溶液浸漬過夜，回流提取；提取液過濾，濾液減壓回收至無醇味，定容，得到仙靈骨葆原料粉提取物；（4）將仙靈骨葆原料粉提取物混懸於蒸餾水中，離心，抽濾，取濾液上色譜柱進行梯度洗脫，分別收集洗脫物，減壓回收至無醇味，定容，得到仙靈骨葆分離提取物。

2020年7月14日，《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》獲得第二十一屆中國專利優秀獎。

基本介紹

中文名：一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑
公布號：CN103083521A
地址：貴州省貴陽市小河區西南環線296號
公布日：2013年05月08日
發明人：周寧，王曉春，姚新生，秦嶺，戴毅，王新巒，馮澤熹，張志強，孫宜春，曾香蘭，龐媛媛，王飛
申請號：2013100550793
Int. Cl.：A61K36/8964(2006.01)I; A61P19/10(2006.01)I
申請日：2013年02月20日
專利代理機構：北京弘權智慧財產權代理事務所(普通合夥)
申請人：貴州同濟堂製藥有限公司
代理人：郭放；張文
專利類型：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

骨質疏鬆症是一個世界範圍的、越來越引起人們重視的健康問題，2013年，全世界約2億人患有骨質疏鬆症，其發病率已躍居常見病、多發病的第七位。最新研究表明，在我國一直被認為是老年人特有疾病的骨質疏鬆症，實際上在兒童時期就已存在。特別需要強調的是，醫學上還未有安全而有效的根治方法，幫助已疏鬆的骨骼恢復原狀，因此，正確認識、早期預防顯得尤為重要。隨著人口老齡化日趨明顯，作為中老年多發的退行性疾病一骨質疏鬆症及其併發症，已成為一個社會性的健康問題而備受老年病學者的關注，並引起了各國政府的高度重視。骨質疏鬆症的主要危險結果是易致骨折，像高血壓病控制不好易致中風一樣，骨質疏鬆症在西方發展國家的婦女中發生率高，在美國約有2500萬患者，每年約有150萬患者並發骨折，約20％的骨折患者在1年內因並發肺栓塞、肺炎而死亡，在婦女骨質疏鬆性骨折而致的死亡率超過乳房癌、宮頸癌和子宮體癌的總和，半數髖部骨折的存活者失去獨立生活的能力，約20％的患者只能生活在護理院中。骨質疏鬆性骨折醫療費用耗資巨大，1984年美國估計61億美元，最近估計達100億美元，隨著人口的不斷老齡化和平均期望壽命增長，如果不採取有效的干預，未來的25年，此項醫療引導可能還要成倍增長。邁入21世紀，我國人口已近13億，60歲以上的人群達10％，這標誌著我國開始進入老齡社會，骨質疏鬆症病人勢必迅猛增加。在我國已經構成一個嚴重的公眾健康問題。

仙靈骨葆製劑是用於治療骨質疏鬆的一種成熟製劑，2013年技術也公開了各種仙靈骨葆製劑及其製備方法。

中國申請NO.201110317157.3公開了一種仙靈骨葆複方的提取物、含其製劑及其製備方法，仙靈骨葆提取物是由以下重量份的中藥製成：淫羊藿600-1500份、丹參50-150份、補骨脂50-150份、續斷80-200份、知母50-150份和地黃50-150份，其活性成分為：丹參和補骨脂的醇提物，淫羊藿、續斷、知母和地黃的水提物。製備時取淫羊藿的水提物，丹參、補骨脂的醇提物，知母、續斷和地黃的水提物，混合均勻，即得仙靈骨葆提取物。

中國申請NO.200410051606.4公開了仙靈骨葆新製劑及其製備方法和用途，製劑的有效成分中包括淫羊藿、續斷、丹參、知母、補骨脂、地黃，所用藥材配比為：淫羊藿1167、續斷167、丹參83、知母83、補骨脂83、地黃83；以上六味，續斷、丹參、補骨脂粉碎成細粉，其餘淫羊藿等三味加水煎煮三次，每次1小時，合併煎液，濃縮至相對密度為1.35～1.38（30℃）的稠膏，加入上述藥材細粉，混勻，乾燥，粉碎；即得製備分散片或軟膠囊的提取物；上述組份的藥材提取物配合採用適當種類的藥學上所稱的輔料或基質製成仙靈骨葆軟膠囊、分散片、包衣分散片，如與分散介質、助懸劑、防腐劑製成軟膠囊，或與填充劑、崩解劑、潤濕劑、潤滑劑製成分散片。

上述技術方案均採用將處方中6味原料分別或部分混合提取，再將所得提取物混合即得仙靈骨葆提取物，向其中加入藥學上可用的輔料，製備成仙靈骨葆的相關製劑。此外，2013年技術還公開了其他仙靈骨葆製劑的技術方案，均是從個別原料的提取或者製劑輔料的選擇及製劑方法的角度展開的。發明人在實際深入研究中發現，長期服用仙靈骨葆製劑對人體產生一定的副作用，而2013年技術公開的各種改進技術方案對此改善並不顯著，因此，時下急待找到一種理想的仙靈骨葆提取物及其製劑，在減少副作用的前提下，還能明顯提高製劑的療效。

發明內容

專利目的

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》的第一目的是在2013年處方的基礎上，通過對仙靈骨葆原料粉末進一步提取，得到一種全新的仙靈骨葆分離提取物，以提高活性成分的穩定性，顯著改善製劑的療效。

技術方案

為實現《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》的第一目的，採用如下技術方案：

一種仙靈骨葆提取物，所述的提取物經由以下方法提取得到：

（1）按重量份計稱取淫羊藿600-1500份、丹參50-150份、補骨脂50-150份、續斷80-200份、知母50-150份和地黃50-150份；

（2）將斷續、丹參、補骨脂粉碎成細粉；淫羊藿、知母和地黃混合後經水提得到水提物，濃縮至稠膏，加入上述細粉，混勻，乾燥，得到仙靈骨葆原料粉；

（3）取和/或稱量所述仙靈骨葆原料粉，以10-95%的乙醇水溶液浸漬過夜，回流提取1-3次，每次1-3小時；提取液過濾，濾液減壓回收溶劑至無醇味，加入蒸餾水定容，混合均勻，得到仙靈骨葆原料粉提取物；

（4）將仙靈骨葆原料粉提取物混懸於蒸餾水中，離心，抽濾，取濾液上大孔吸附樹脂色譜柱，分別以水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液梯度洗脫，分別收集水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液的洗脫物，減壓回收溶劑至無醇味，加入蒸餾水定容，混合均勻，得到仙靈骨葆分離提取物。這裡的仙靈骨葆分離提取物為流程圖中所示的XLGB-A,XLGB-B和XLGB-C。

其中，優選所述步驟1中各原料藥分別為：淫羊藿1000-1200份、丹參70-100份、補骨脂70-100份、續斷150-180份、知母70-100份和地黃70-100份。

更優選所述步驟1中各原料藥分別為：淫羊藿1167份、丹參83份、補骨脂83份、續斷167份、知母83份和地黃83份。

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》的第二目的在於提供一種仙靈骨葆的提取方法，為實現第二目的，採用如下技術方案：

（1）按重量份計稱取淫羊藿600-1500份、丹參50-150份、補骨脂50-150份、續斷80-200份、知母50-150份和地黃50-150份，優選地淫羊藿1167份、丹參83份、補骨脂83份、續斷167份、知母83份和地黃83份;

（3）取和/或稱量所述仙靈骨葆原料粉，以乙醇水溶液浸漬過夜，回流提取；提取液過濾，濾液減壓回收溶劑至無醇味，加入蒸餾水定容，混合均勻，得到仙靈骨葆原料粉提取物；

（4）將仙靈骨葆原料粉提取物混懸於蒸餾水中，離心，抽濾，取濾液上色譜柱，分別以水和乙醇水溶液進行梯度洗脫，優選地以水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液梯度洗脫，分別收集水和乙醇水溶液的洗脫物，減壓回收溶劑至無醇味，加入蒸餾水定容，混合均勻，得到仙靈骨葆分離提取物。這裡的仙靈骨葆分離提取物為流程圖中所示的XLGB-A,XLGB-B和XLGB-C。

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》的核心在於，沿用傳統處方，將採用2013年提取工藝所得的仙靈骨葆原料粉進一步提取和分離，得到全新的仙靈骨葆分離提取物，該全新的分離提取物能以顯著低於2013年仙靈骨葆製劑的劑量，獲得更好的治療效果，並有力控制藥物可能帶來的不良反應。

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》所述仙靈骨葆原料粉可經由2013年技術公開的各種方法製備，如背景技術中所提及的中國申請CN201110317157.3和中國申請CN200410051606.4中公開的技術方案。作為《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》的一種更理想的實施方式，優選所述的步驟2為：將斷續、丹參、補骨脂粉碎成細粉；淫羊藿、知母和地黃加水煎煮2-4次，每次0.5-4小時，優選地加水煎煮三次，時間分別為3、2、1小時，合併煎液，濃縮至30℃下相對密度為1.35-1.38的稠膏，加入上述細粉，混勻，乾燥，得仙靈骨葆原料粉。

此外，更優選地，《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》還可以採用如下方法對處方原料藥進行處理：將斷續、丹參、補骨脂粉碎成2-4目的細粉；淫羊藿、知母和地黃加水煎煮2-4次，每次0.5-4小時，合併煎液，高速離心，上清液用聚碸中空纖維膜（3000道爾頓）濾過，濾液濃縮至30℃下相對密度為1.35-1.38的稠膏，加入上述細粉，混勻，乾燥，得仙靈骨葆原料粉。

採用這種提取方式，能夠更大程度地將原料藥中的活性成分提取出來，有助於後續的進一步提取分離。

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》對仙靈骨葆原料粉的處理優選通過如下步驟來實現：取和/或稱量仙靈骨葆原料粉，以8-12倍50-75%的乙醇水溶液浸漬過夜、優選10倍60%的乙醇水溶液浸漬過夜，優選在加熱條件下回流提取1-3次，每次1-3小時；提取液過濾，濾液減壓回收溶劑至無醇味，加入10-20倍量蒸餾水定容，混合均勻，得到所述仙靈骨葆原料粉提取物；其中，在一個優選的方式中，取仙靈骨葆原料粉，以10倍60%的乙醇水溶液浸漬過夜，加熱回流提取2次，每次2小時；提取液過濾，濾液減壓回收溶劑至無醇味，加入15倍量蒸餾水，混合均勻，得到仙靈骨葆原料粉提取物。

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》的提取方法還包括計算所述仙靈骨葆原料粉提取物中乾物質收率的步驟，該步驟具體包括稱取一小部分所述仙靈骨葆原料粉提取液，用水稀釋，冷凍乾燥，得到乾物質，計算收率。

在步驟（3）中，通過將含有6味原材料或其提取物的仙靈骨葆原料粉進一步提取，選擇適宜的提取條件，能夠初步有效去除其中對人體會產生不良反應的物質，提高製劑整體的療效。

在所述步驟（4）中，將所述仙靈骨葆原料粉提取物混懸於按重量計10-15倍量蒸餾水中，對所得溶液進行第一次離心，抽濾，取濾液上大孔吸附樹脂色譜柱，分別以水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液洗脫、優選地以水、30%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液梯度洗脫，分別收集各自的洗脫物，減壓回收溶劑至無醇味，加入10-20倍蒸餾水定容，混合均勻，得到仙靈骨葆分離提取物。

所述步驟4中所述大孔吸附樹脂為大孔吸附樹脂HP-20色譜柱；水、30%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液用作洗脫液。在所述步驟4中，色譜柱體積按體積計為上樣量的0.8-1.2倍，作為洗脫液的水的用量為4倍的柱體積，25-40%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積，75-98%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積。

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》方法還包括將第一次離心後的濾渣以25-40%乙醇混旋，進行第二次離心，將所得的上清液上大孔吸附樹脂色譜柱，以25-40%乙醇水溶液洗脫，得到洗脫物，合併入步驟4中得到的25-40%乙醇水溶液的洗脫物；將第二次離心後的濾渣合併入步驟4中得到的75-98%乙醇水溶液的洗脫物。

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》方法還包括計算水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液的洗脫物中的乾物質收率的步驟，其包括在對水、25-40%乙醇水溶液、75-98%乙醇水溶液的洗脫物減壓回收溶劑至無醇味後，用蒸餾水進行定容，取一小部分用蒸餾水進行稀釋，冷凍乾燥，得到乾物質，計算收率。

冷凍乾燥過程可以分三步進行:預凍結、低溫真空升華乾燥和高溫乾燥。由於該品為中藥，粘性大不易成形而且凍乾體積較大，預凍不易凍實等特點，在凍乾程式升溫中設計了三個平台期。具體方法為將冷凍箱預凍至溫度為-25℃後，再將凍乾原液置冷凍箱中，待樣品冷至預凍溫度後，保持冷凍5小時，然後抽真空（20帕），以2℃/hr程式升溫，在-15℃時保溫10小時，最後以5℃/hr降溫至-25℃乾燥，保持5小時，封口即得。凍乾後產品成型性、復溶性良好，含水量低。確定以此為最終凍乾條件。

該領域技術人員知道，中藥的提取是一個複雜的過程，期間不僅發生有效活性成分的溶出，也有不同組分間相互轉化、結合或影響。因此，採用不同的提取方法，得到的提取物組成不盡相同。即使採用相同的提取方法，改變提取條件，如溶劑、提取方式、提取時間、溫度等，同樣會使提取物發生變化。發明人長期致力於仙靈骨葆製劑的研究，結果表明，將處方中6味原料藥提取物混合後經過二次提取能夠集中將仙靈骨葆的活性成分提取出來，在明顯提高藥效的同時，副作用也得到相當顯著的控制，究其原因，可能是混合二次提取的過程中，6種原材料中容易引起人體副作用的組分間發生了某些結合或者轉化，在二次提取過程中被分離。此外，《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》要求保護的最終提取物穩定性較2013年的仙靈骨葆提取物有顯著提高。

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》還涉及仙靈骨葆分離提取物，通過上述的《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》的方法提取得到。《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》的第三目的在於提供一種含有上述仙靈骨葆分離提取物的仙靈骨葆製劑。所述仙靈骨葆分離提取物經過乾燥優選冷凍乾燥而製備仙靈骨葆製劑。在一個可替代的方案中，《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》所述的仙靈骨葆製劑由所述仙靈骨葆分離提取物（即XLGB-A,XLGB-B和XLGB-C）經乾燥優選冷凍乾燥後與藥學上可接受的輔料製備而成。具體輔料的選擇及其用量的確定為該領域技術人員所掌握。

優選所述的仙靈骨葆製劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或粉針劑。

上述仙靈骨葆片劑按重量份計，可包括如下組成：仙靈骨葆提取物30-99份和輔料1-70份。片劑的製備方法可採用2013年技術公開的任一種來實現。

上仙靈骨葆膠囊劑，按重量份計，可包括如下組成：仙靈骨葆提取物50-99份和輔料1-50份。膠囊劑的製備方法可採用2013年技術公開的任一種來實現。

上仙靈骨葆口服劑，按重量份計，可包括如下組成：仙靈骨葆提取物40-90份和輔料10-60份。口服劑的製備方法可採用2013年技術公開的任一種來實現。

上仙靈骨葆粉針劑，按重量份計，可包括如下組成：仙靈骨葆提取物35-99份和輔料1-65份。粉針劑的製備方法可採用2013年技術公開的任一種來實現。

上仙靈骨葆顆粒劑，按重量份計，可包括如下組成：仙靈骨葆提取物45-99份和輔料1-55份。顆粒劑的製備方法可採用2013年技術公開的任一種來實現。

改善效果

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》所述的仙靈骨葆製劑在穩定性和療效上較2013年技術得到了顯著改善。

附圖說明

圖1是仙靈骨葆的提取流程圖。

技術領域

《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》涉及一種仙靈骨葆的提取方法，具體涉及一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑。

權利要求

1.一種仙靈骨葆的提取方法，其特徵在於，所述提取方法包括如下步驟：（1）按重量份計稱取淫羊藿600-1500份、丹參50-150份、補骨脂50-150份、續斷80-200份、知母50-150份和地黃50-150份；（2）將斷續、丹參、補骨脂粉碎成細粉；淫羊藿、知母和地黃混合後經水提得到水提物，濃縮至稠膏，加入上述細粉，混勻，乾燥，得到仙靈骨葆原料粉；（3）取和/或稱量所述仙靈骨葆原料粉，以10-95％乙醇水溶液浸漬過夜，回流提取；提取液過濾，濾液減壓回收溶劑至無醇味，加入蒸餾水定容，混合均勻，得到仙靈骨葆原料粉提取物；（4）將仙靈骨葆原料粉提取物混懸於蒸餾水中，離心，抽濾，取濾液上色譜柱，分別以水、25-40％乙醇水溶液、75-98％乙醇水溶液梯度洗脫，分別收集水和乙醇水溶液的洗脫物，減壓回收溶劑至無醇味，加入蒸餾水定容，將所得的水和乙醇水溶液的洗脫物混合均勻，得到仙靈骨葆分離提取物,其中在所述步驟（4）中，色譜柱體積按體積計為上樣量的0.8-1.2倍，作為洗脫液的水的用量為4倍的柱體積，25-40％的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積，75-98％的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積。

2.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，在所述步驟（2）中，淫羊藿、知母和地黃加水煎煮2-4次，每次0.5-4小時，合併煎液，濃縮至30℃下相對密度為1.35-1.38的稠膏，加入上述細粉，混勻，乾燥，得到仙靈骨葆原料粉。

3.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，在所述步驟（3）中，取仙靈骨葆原料粉，以8-12倍的50-75％的乙醇水溶液浸漬過夜，在加熱條件下回流提取1-3次，每次1-3小時；提取液過濾，濾液減壓回收溶劑至無醇味，加入10-20倍量蒸餾水定容，混合均勻，得到所述仙靈骨葆原料粉提取物。

4.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，所述方法還包括計算所述仙靈骨葆原料粉提取物中乾物質收率的步驟，其包括稱取一小部分所述仙靈骨葆原料粉提取液，用水稀釋，冷凍乾燥，得到乾物質，計算收率。

5.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，在所述步驟（4）中，將所述仙靈骨葆原料粉提取物混懸於按重量計10-15倍量蒸餾水中，對所得溶液進行第一次離心，抽濾，取濾液上大孔吸附樹脂色譜柱，以水、30％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液梯度洗脫，分別收集各自的洗脫物，減壓回收溶劑至無醇味，加入10-20倍蒸餾水定容，混合均勻，得到仙靈骨葆分離提取物。

6.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，所述方法還包括將第一次離心後的濾渣以25-40％乙醇混旋，進行第二次離心，將所得的上清液上大孔吸附樹脂色譜柱，以25-40％乙醇水溶液洗脫，得到洗脫物，合併入步驟（4）中得到的25-40％乙醇水溶液的洗脫物；將第二次離心後的濾渣合併入步驟（4）中得到的75-98％乙醇水溶液的洗脫物。

7.根據權利要求3或6所述的提取方法，其特徵在於，所述方法還包括計算水、25-40％乙醇水溶液、75-98％乙醇水溶液的洗脫物中的乾物質收率的步驟，其包括在對水、25-40％乙醇水溶液、75-98％乙醇水溶液的洗脫物減壓回收溶劑至無醇味後，用蒸餾水進行定容，取一小部分用蒸餾水進行稀釋，冷凍乾燥，得到乾物質，計算收率。

8.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，在步驟（1）中按重量份計稱取淫羊藿1167份、丹參83份、補骨脂83份、續斷167份、知母83份和地黃83份。

9.根據權利要求2所述的提取方法，其特徵在於，在所述步驟（2）中，淫羊藿、知母和地黃加水煎煮3次，時間分別為3、2、1小時。

10.根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於，在所述步驟（3）中，取仙靈骨葆原料粉，以10倍60％的乙醇水溶液浸漬過夜，在加熱條件下回流提取2次，每次2小時；提取液過濾，濾液減壓回收溶劑至無醇味，加入10-20倍量蒸餾水定容，混合均勻，得到所述仙靈骨葆原料粉提取物。

11.一種仙靈骨葆分離提取物，其特徵在於，所述分離提取物通過權利要求1-10中任一項所述的方法提取得到。

12.含有權利要求11所述仙靈骨葆分離提取物的仙靈骨葆製劑。

實施方式

實施例1

按重量份計稱取淫羊藿1167份、丹參83份、補骨脂83份、續斷167份、知母83份和地黃83份；將斷續、丹參、補骨脂粉碎成細粉；淫羊藿、知母和地黃混合後加水煎煮三次，時間分別是3、2、1小時，合併煎液，濃縮至30℃下相對密度為1.35-1.38的稠膏，加入上述斷續、丹參、補骨脂的細粉，混勻，乾燥，得到仙靈骨葆原料粉。

稱取仙靈骨葆原料粉800克，以按重量計10倍量的60%的乙醇水溶液浸漬過夜，加熱回流提取2次，每次2小時；提取液用四層紗布過濾，合併濾液，減壓濃縮至無醇味。加入蒸餾水定容至5000毫升。混合均勻後，取450毫升，稀釋後冷凍乾燥，得到乾物質46.63克。以此推算，800克“仙靈骨葆”原料粉的提取物（XLGB）的乾物質約有518.1克，收率約為64.8％。

稱取仙靈骨葆原料粉的提取物（乾物質）450克，混懸於5L蒸餾水中，3000轉每分離心（稱為第一次離心）30分，上清液抽濾後，取濾液上大孔吸附樹脂HP-20色譜柱（Φ9×70厘米，事先用15L蒸餾水平衡），分別以水、30％乙醇-水溶液、95％（v/v）乙醇-水溶液梯度洗脫。HP-20色譜柱的柱體積為上樣溶液的0.8-1.2倍。離心後的濾渣分次以30%乙醇混旋，3000轉每分進行第二次離心持續半小時，30%乙醇用量不超過1個柱體積。第二次離心所得的濾液上樣至經水洗脫後的HP-20色譜柱，濾渣與95%的乙醇-水洗脫物混合。作為洗脫液的水的用量為4倍的柱體積，25-40%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積，75-98%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積。分別收集各洗脫物，減壓回收溶劑至無醇味後，用蒸餾水定容，混合均勻。取少量進一步用蒸餾水稀釋，冷凍乾燥。以此推算，各部分乾物質分別為水洗脫物227.2克（XLGB-A，58.9％）、30％（v/v）乙醇-水洗脫物61.3克（XLGB-B，13.0％）和95％（v/v）乙醇-水洗脫物109.3克（XLGB-C，23.2％）。計算總收率為95.1％。參見圖1，圖1為仙靈骨葆原料粉提取及分離的流程圖。將所得的水洗脫物、30％乙醇-水洗脫物、95％（v/v）乙醇-水洗脫物合併，冷凍乾燥，製備得到仙靈骨葆的分離提取物。得到用於製備仙靈骨葆製劑的提取物，即以下實驗組1中的提取物。

實施例2

按重量份計稱取淫羊藿1167份、丹參83份、補骨脂83份、續斷167份、知母83份和地黃83份；將斷續、丹參、補骨脂粉碎成細粉；淫羊藿、知母和地黃混合後加水煎煮三次，時間分別是2、2、1.5小時，合併煎液，濃縮至30℃下相對密度為1.35-1.38的稠膏，加入上述斷續、丹參、補骨脂的細粉，混勻，乾燥，得到仙靈骨葆原料粉。

稱取仙靈骨葆原料粉800克，以按重量計15倍量的60%的乙醇水溶液浸漬過夜，加熱回流提取2次，分別為2和1小時；提取液用四層紗布過濾，合併濾液，減壓回收溶劑至無醇味。加入蒸餾水定容至5000毫升。混合均勻後，取450毫升，稀釋後冷凍乾燥，得到乾物質47克。以此推算，800克“仙靈骨葆”原料粉的提取物（XLGB）的乾物質約有520克，收率約為65％。

稱取仙靈骨葆原料粉的提取物450克，混懸於5L蒸餾水中，3000轉每分離心30分，上清液抽濾後，取濾液上大孔吸附樹脂HP-20色譜柱（Φ9×70厘米，事先用15L蒸餾水平衡），分別以水、30％乙醇-水溶液、95％（v/v）乙醇-水溶液梯度洗脫。HP-20色譜柱的柱體積為上樣溶液的0.8-1.2倍。離心後的濾渣分次以30%乙醇混旋，3000轉每分進行第二次離心持續半小時，30%乙醇用量不超過1個柱體積。第二次離心所得的濾液上樣至經水洗脫後的HP-20色譜柱，濾渣與95%的乙醇-水洗脫物混合。作為洗脫液的水的用量為4倍的柱體積，30%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積，95%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積。分別收集各洗脫物，減壓回收溶劑至無醇味後，用蒸餾水定容，混合均勻。取少量進一步用蒸餾水稀釋，冷凍乾燥。以此推算，各部分乾物質分別為水洗脫物231.3克（XLGB-A，58.9％）、30％（v/v）乙醇-水洗脫物63克（XLGB-B，13.0％）和95％（v/v）乙醇-水洗脫物112克（XLGB-C，23.2％）。計算總收率為95.8％。製備流程圖參見圖1。將所得的水洗脫物、30％乙醇-水洗脫物、95％（v/v）乙醇-水洗脫物合併，冷凍乾燥，得到用於製備仙靈骨葆製劑的提取物，即以下實驗組2中的提取物。

實施例3

按重量份計稱取淫羊藿600份、丹參50份、補骨脂50份、續斷80份、知母50份和地黃50份；將斷續、丹參、補骨脂粉碎成細粉；淫羊藿、知母和地黃混合後加水煎煮三次，時間分別是3、2、1小時，合併煎液，濃縮至30℃下相對密度為1.35-1.38的稠膏，加入上述斷續、丹參、補骨脂的細粉，混勻，乾燥，得到仙靈骨葆原料粉。

稱取仙靈骨葆原料粉800克，以按重量計10倍量的50%的乙醇水溶液浸漬過夜，加熱回流提取2次，每次2小時；提取液用四層紗布過濾，合併濾液，減壓濃縮至無醇味。加入蒸餾水定容至5000毫升。混合均勻後，取450毫升，稀釋後冷凍乾燥，得到乾物質47.1克。

稱取仙靈骨葆原料粉的提取物450克，混懸於5L蒸餾水中，3000轉每分離心30分，上清液抽濾後，取濾液上大孔吸附樹脂HP-20色譜柱（Φ9×70厘米，事先用15L蒸餾水平衡），分別以水、25％乙醇-水溶液、75％（v/v）乙醇-水溶液梯度洗脫。HP-20色譜柱的柱體積為上樣溶液的0.8-1.2倍。離心後的濾渣分次以30%乙醇混旋，3000轉每分進行第二次離心持續半小時，30%乙醇用量不超過1個柱體積。第二次離心所得的濾液上樣至經水洗脫後的HP-20色譜柱，濾渣與75%的乙醇-水洗脫物混合。作為洗脫液的水的用量為4倍的柱體積，25%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積，75%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積。分別收集各洗脫物，減壓回收溶劑至無醇味後，用蒸餾水定容，混合均勻。取少量進一步用蒸餾水稀釋，冷凍乾燥。以此推算，各部分乾物質分別為水洗脫物231克（XLGB-A，58.9％）、25％（v/v）乙醇-水洗脫物60.2克（XLGB-B，13.0％）和75％（v/v）乙醇-水洗脫物113克（XLGB-C，23.2％）。將所得的水洗脫物、25％乙醇-水洗脫物、75％（v/v）乙醇-水洗脫物合併，冷凍乾燥，製備得到仙靈骨葆的分離提取物。得到用於製備仙靈骨葆製劑的提取物。

實施例4

按重量份計稱取淫羊藿1500份、丹參150份、補骨脂150份、續斷200份、知母150份和地黃150份；將斷續、丹參、補骨脂粉碎成細粉；淫羊藿、知母和地黃混合後加水煎煮三次，時間分別是3、2、1小時，合併煎液，濃縮至30℃下相對密度為1.35-1.38的稠膏，加入上述斷續、丹參、補骨脂的細粉，混勻，乾燥，得到仙靈骨葆原料粉。

稱取仙靈骨葆原料粉800克，以按重量計10倍量的75%的乙醇水溶液浸漬過夜，加熱回流提取2次，每次2小時；提取液用四層紗布過濾，合併濾液，減壓濃縮至無醇味。加入蒸餾水定容至5000毫升。混合均勻後，取450毫升，稀釋後冷凍乾燥，得到乾物質46.8克。

稱取仙靈骨葆原料粉的提取物450克，混懸於5L蒸餾水中，3000轉每分離心30分，上清液抽濾後，取濾液上大孔吸附樹脂HP-20色譜柱（Φ9×70厘米，事先用15L蒸餾水平衡），分別以水、40％乙醇-水溶液、98％（v/v）乙醇-水溶液梯度洗脫。HP-20色譜柱的柱體積為上樣溶液的0.8-1.2倍。離心後的濾渣分次以30%乙醇混旋，3000轉每分進行第二次離心持續半小時，30%乙醇用量不超過1個柱體積。第二次離心所得的濾液上樣至經水洗脫後的HP-20色譜柱，濾渣與98%的乙醇-水洗脫物混合。作為洗脫液的水的用量為4倍的柱體積，40%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積，98%的乙醇水溶液用量為4倍的柱體積。分別收集各洗脫物，減壓回收溶劑至無醇味後，用蒸餾水定容，混合均勻。取少量進一步用蒸餾水稀釋，冷凍乾燥。以此推算，各部分乾物質分別為水洗脫物225克（XLGB-A，58.9％）、40％（v/v）乙醇-水洗脫物60.6克（XLGB-B，13.0％）和98％（v/v）乙醇-水洗脫物102.3克（XLGB-C，23.2％）。將所得的水洗脫物、40％乙醇-水洗脫物、98％（v/v）乙醇-水洗脫物合併，冷凍乾燥，製備得到仙靈骨葆的分離提取物。得到用於製備仙靈骨葆製劑的提取物。

實施例5

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計80份與輔料20份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆片劑。

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計85份與輔料15份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆片劑。

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計90份與輔料10份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆片劑。

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計75份與輔料25份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆片劑。

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計60份與輔料40份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆片劑。

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計82份與輔料18份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆膠囊劑。

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計65份與輔料35份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆膠囊劑。

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計72份與輔料28份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆膠囊劑。

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計88份與輔料12份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆膠囊劑。

將實施例1中獲得的分離提取物按重量計92份與輔料8份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆膠囊劑

或者，將實施例1中獲得的分離提取物按重量計80份與輔料20份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆膠囊劑。

或者，將實施例1中獲得的分離提取物按重量計90份與輔料10份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆口服劑。

或者，將實施例1中獲得的分離提取物按重量計55份與輔料45份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆口服劑。

或者，將實施例1中獲得的分離提取物按重量計40份與輔料60份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆口服劑。

或者，將實施例1中獲得的分離提取物按重量計45份與輔料55份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆粉針劑。

或者，將實施例1中獲得的分離提取物按重量計50份與輔料50份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆粉針劑。

或者，將實施例1中獲得的分離提取物按重量計95份與輔料5份混合，按照常規工藝製備仙靈骨葆粉針劑。

為了進一步介紹《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》所述仙靈骨葆提取物，發明人還做了一系列對比實驗。

試驗方法：

1.試驗材料

1.1藥物及試劑

1.1.1試驗組別及藥物：

實驗組1：《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》實施例1所製備的仙靈骨葆提取物

實驗組2：《一種仙靈骨葆的提取方法、分離提取物及製劑》實施例2所製備的仙靈骨葆提取物

對照組1：申請號No.201110317157.3的中國申請（公開號為CN102343027A，公開日為2012年2月8日）公開的實施例1

對照組2：申請號No.200410051606.4的中國申請公開的實施例1。具體如下：續斷、丹參、補骨脂粉碎成80目細粉，其餘淫羊藿等三味加水煎煮三次，每次1小時，合併煎液，濃縮至相對密度為1.35（30°C）的稠膏，加入上述藥材細粉，混勻；乾燥，粉碎至80目的細粉，即得製備分散片或軟膠囊的藥材提取物。

對照組3：市售的貴州同濟堂製藥有限公司生產的仙靈骨葆膠囊

空白對照組：給等容積生理鹽水

1.2試驗動物

兔：日本大耳白兔種，2.0～2.6千克，雌雄兼用。由貴陽醫學院試驗動物中心提供。

大鼠：SD種，180～250克，雌雄兼用。由貴陽醫學院試驗動物中心提供。

小鼠：昆明種,18～22克，雌雄兼用。由貴陽醫學院試驗動物中心提供。

動物合格證號：SCXK-（黔）2002-0001。

飼料：輻射滅菌顆粒飼料，蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司生產。

飼養條件：動物室環境光照充足，通風良好，室溫18~25℃，濕度50~70%。兔、大鼠置不鏽鋼飼養籠飼養，小鼠置塑膠籠飼養，均雌雄分籠，自由飲水及食料。

1.3主要儀器

圖像分析系統：HPIAS—1000型，同濟醫科大學千屏影像工程公司。

全自動生化分析儀：AbbottAeroset2000型，美國雅培公司。

多探頭放免儀：中國科大中佳公司。

2.試驗設計

2.1給藥途徑：動物試驗給藥途徑與臨床用藥途徑相一致，採用灌胃給藥方法。

2.2試驗周期：試驗周期見各試驗具體方法。

2.3數據處理：試驗數據用NDST軟體進行t檢驗或X2檢驗。

3.試驗方法及結果

3.1骨折治療試驗

3.1.1對兔骨折癒合的影響：取日本大耳白兔，戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉，仰臥位固定，左前肢去毛，皮膚常規消毒，於左前肢橈側屈面縱行切開皮膚2～3厘米，分離肌肉，避開血管神經，暴露橈骨中遠段交界處，以特製鋼鋸橫向鋸斷橈骨，形成3毫米切損的完全性骨折。將錯開的骨折端復位，逐層縫合（術後7天傷口拆線），傷口包紮，但不固定。術後次日拆除敷料，將54隻骨折動物隨機分為6組（每組動物9隻，雌雄兼用，體重2.31±0.18千克）：實驗組1（2克/千克，臨床成人日用量的10倍）、實驗組2（2克/千克，臨床成人日用量的10倍）、對照組1（2克/千克，臨床成人日用量的10倍）、對照組2（2克/千克，臨床成人日用量的10倍）、對照組3（2克/千克，臨床成人日用量的10倍）。空白對照組（給等容量生理鹽水）。動物均灌胃給藥，每日1次，連續28天。試驗期間進行下述項目的觀察：

3.1.1.1骨折肢支撐著地時間的比較：骨折後，動物為避痛，患肢不敢著地，空抬患肢。經過恢復，當患肢敢於放在地上並支撐軀體。經過恢復後患肢支撐軀體的時間即為支撐著地時間（單位：小時）。支撐著地時間越長說明恢復效果越好。

結果：實驗組1、實驗組2明顯延長動物骨折肢支撐著地時間,與空白對照組比較，P<0.05。見表1。