《一株高產核酸酶P1的桔青黴菌及其選育方法》是南京工業大學和南京同凱兆業生物技術有限責任公司於2007年5月25日申請的專利，該專利的申請號為2007100229326，公布號為CN101067116，公布日為2007年11月7日，發明人是應漢傑、楊蘊毅、賀沁婷、張磊、阮文輝，該發明屬於微生物誘變技術領域。
《一株高產核酸酶P1的桔青黴菌及其選育方法》所述菌株的選育方法是對桔青黴孢子懸浮液進行低能離子束注入，再將誘變後的孢子轉接於平板培養基中培養，挑選單個菌株轉接於麥芽汁斜面培養，後經液體發酵培養，篩選出產核酸酶P1酶活高的菌株。該菌株經30代以上傳代，得高產性狀穩定的菌株。該發明採用低能離子束注入的方法，誘變效果好，正突變率高，且操作安全，菌株經發酵產生的核酸酶P1的酶活提高了3～5倍，高產性狀穩定，不易丟失，經3噸發酵罐培養後酶活力仍能保持較高水平，適合大規模工業化生產。
2011年，《一株高產核酸酶P1的桔青黴菌及其選育方法》獲得第七屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一株高產核酸酶P1的桔青黴菌及其選育方法
- 公布號：CN101067116
- 公布日：2007年11月7日
- 申請號：2007100229326
- 申請日：2007年5月25日
- 申請人：南京工業大學、南京同凱兆業生物技術有限責任公司
- 地址：江蘇省南京市新模範馬路5號
- 發明人：應漢傑、楊蘊毅、賀沁婷、張磊、阮文輝
- 分類號：C12N1/15（2006.01）、C12N15/55（2006.01）、C12N9/22（2006.01）
- 代理機構：南京天華專利代理有限責任公司
- 類別：發明專利
- 代理人：徐冬濤、劉成群
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,菌株信息,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
從桔青黴發酵液中獲得的核酸酶P1是一種能夠水解RNA獲得四種5’一核苷酸的磷酸二酯酶。5’-核苷酸已廣泛套用於食品、生化工業以及製藥工業。在食品行業中，已經由最初的食品助鮮劑，擴展為具有提高生物體免疫功能的功能性食品添加劑，可以添加在麵包、餅乾等食品中，尤其在嬰幼兒食品中的使用效果非常明顯，能夠有效增強嬰幼兒抵細菌性痢疾的能力，減少腹瀉的發生；在醫藥領域，5’-核苷酸不但能夠作為藥物使用而且還是許多抗病毒抗腫瘤藥物的生產原料；此外，核苷酸製劑還可以作為動植物生長節劑，有著增產、增重功效。
核苷酸生產主要採取三種方法：化學合成法、微生物發酵法及酶解法。酶解法由於降解RNA可以一次得到四種核苷酸的混合物，且酶反應收率較高，中國國內外工業化生產苷酸均採用此法。在酶解法製備核苷酸中由桔青黴經液體深層發酵生產核酸酶P1，其解產物雜質少後續分離工藝簡單，中國國外一般採用該方法進行核苷酸的生產。
桔青黴（Penicillium citrinum）屬於不對稱青黴組，絨狀青黴亞組，桔青黴系。中國國內桔青黴菌株一般採用紫外誘變和亞硝基胍等方法進行誘變選育。陳信波（湖南農業大學報，1995，21（4）：382-385）等採用紫外誘變法，酶活為500u/毫升。洪亦武等（江西學，1995，13（4），224-228）採用亞硝基胍和紫外複合誘變，菌株致死率大於90％，終酶活為345u/毫升。李科德等（微生物雜誌，2001，21（3）：28-30）採用紫外誘變與硝基胍多次誘變，最佳化後酶活為1329u/毫升。
離子束注入技術作為一種生物品種改良的新技術已在誘變育種、植物轉基因、生命起源和進化以及環境輻射與人類健康等方面取得了一些重要研究成果。在微生物誘變種的研究中，離子束注入已廣泛用於對微生物菌種誘變育種，並取得了良好效果。離子注入與傳統誘變源相比，除了具有能量沉積效應外，還有動量傳遞、質量沉積及電荷的中和與交換效應，是一種將物理誘變和化學誘變特性集於一身的綜合誘變方法，能夠在劑量注入、細胞損傷較輕的情況下，誘發強烈地影響生物細胞的生理、生化性能，造成遺物質的基本單位-鹼基的改變，誘發染色體結構變異（余增亮物理199726（6）:333-338）。趙洪英（天津理工學院學報，2001，17（1）:14-17）等用N離子注入慶大黴素產生菌成熟孢子，經篩選得到的菌株產抗生素能力提高27.39％。王紀（微物學雜誌，1998，18（4）：25-28）等通過離子注入誘變篩選得到一株遺傳性能穩定的高菌，得率較出發菌株提高55％～60％。將離子注入誘變技術套用於桔青黴生產核酸酶P方面未見相關專利和文獻報導。
發明內容
專利目的
《一株高產核酸酶P1的桔青黴菌及其選育方法》目的是提供一株高產核酸酶P1的桔青黴菌。
該發明的另一個目的是提供一種利用低能離子束注入誘變手段選育該桔青黴菌的方法。
技術方案
一種高產核酸酶P1的菌株，其分類命名為桔青黴（Penicillium citrinum），已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.2014。
所述菌株的選育方法，該方法是對桔青黴孢子進行低能離子束注入，然後將誘變後的孢子轉接於平板培養基中培養，挑選單個菌株轉接於麥芽汁斜面培養，後經液體發酵養，篩選出產核酸酶P1酶活高的菌株。
所述菌株的選育方法，其中需採用低能離子束注入誘變的桔青黴孢子是取麥芽汁斜面培養的桔青黴孢子用無菌水稀釋製成10～10孢子懸浮液，將0.005～1毫升濃度的孢子懸浮液分裝於玻璃表面皿中，無菌乾燥0.5～2小時。
所述菌株的選育方法，其中低能離子為N、Ar、O或C。
所述菌株的選育方法，其中離子注入機靶室內真空度為2×10～2×10，注入能量為0.1kev～1000kev，劑量為5～500×10ions·厘米·秒。
所述菌株的選育方法，其中經誘變後的孢子懸浮液經無菌水稀釋10～1000倍後，取0.01～1.0毫升塗布於PDA平板培養基中28～32℃培養5～10天，然後轉接於麥芽汁培基斜面上培養5～10天。
所述菌株的選育方法，其中液體發酵培養基組成及含量為：葡萄糖0.5～50克，蛋白腖0.05～5克，磷酸二氫鉀0.01～5克，磷酸氫二鉀0.01～5克，硫酸鎂0.01～5克，氯化鈣.01～5克，定容至1升，pH5～7。
有益效果
《一株高產核酸酶P1的桔青黴菌及其選育方法》採用低能離子束注入的方法對產核酸酶P1的桔青黴菌株進行誘變，與其他誘變方法相比具有一下優點：
1.由於離子束注入誘變是一種集物理和化學誘變特徵於一體的綜合誘變，具有對生物細胞損傷小的特點，因此採用該法誘變的菌株正突變率高，誘變效果好。
2.採用該發明方法選育出的高產核酸酶P1的桔青黴菌株（保藏號為CGMCC No.2014），具有高產性狀穩定，不易丟失的優點，經過30代以上轉接，酶活還能保持選後的水平。
3.採用該發明誘變篩選的菌株在3噸發酵水平發酵，所產的核酸酶P1的酶活仍能保持較高水平，說明該法篩選的菌株有利於大規模工業生產。
菌株信息
《一株高產核酸酶P1的桔青黴菌及其選育方法》公開的高產核酸酶P1的菌株，編號為YL104，其分類命名為桔青黴（Penicillium citrinum），已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡CGMCC，地址：北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所），保藏CGMCC No.2014。保藏日期為2007年4月20日。
權利要求
一種高產核酸酶P1的菌株，其分類命名為桔青黴（Penicillium citrinum），已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.2014。
實施方式
實施例1
取經斜面培養的桔青黴孢子，用無菌水製成10孢子懸浮液，將0.2毫升孢子懸浮液分裝於玻璃表面皿中，無菌乾燥1小時，將待處理的含菌培養皿放入離子注入機內進行連續N離子注入，靶室內真空度為5×10帕，注入能量為30kev，劑量為50～500×10ions·厘米·秒。然後將經誘變後的孢子懸浮液經無菌水稀釋100倍後，取0.05毫升塗布於PDA平板培養基中28～32℃培養7～10天，從中挑選純菌株在麥芽汁斜面培養5～0天后分別轉接於裝25毫升液體發酵培養基（組分：葡萄糖40克，蛋白腖4克，磷酸二氫鉀.06克，磷酸氫二鉀0.06克，硫酸鎂0.06克，氯化鈣0.04克，定容至1升，pH5～7）的25毫升搖瓶中，於28～32℃，250轉每分搖床中培養24小時，過濾去除菌體，測定發酵液中核酸酶P的酶活。經過4批次的誘變篩選，突變株正突變率56.9～63.9％，酶活單位比原始菌株高3.6～5.2倍，結果見表1。
批次 | 出發菌株酶活u/毫升 | 正突變率% | 誘變後最高酶活u/毫升 | 提高倍數 |
1 | 1134 | 15.8 | 4090 | 3.6 |
2 | 980 | 10.2 | 3980 | 4.1 |
3 | 1403 | 18.3 | 6289 | 4.5 |
4 | 992 | 19.3 | 5157 | 5.2 |
其中酶活測定方法：取甲乙兩支試管，分別加5％核酸溶液1毫升和0.8毫升的0.2摩爾/升，pH為5.0的醋酸鹽緩衝液，68℃預熱10分鐘，然後甲管加入0.2毫升的酶液，繼續保溫15分鐘後，甲乙兩管再分別加入2毫升的過氯酸試劑，乙管再補加0.2毫升的酶液，兩管靜置10分鐘後，離心取上清液0.1毫升加7.9毫升蒸餾水，混勻，再稀釋一定的倍數測OD260的值。
酶活計算公式：酶活（u/毫升）＝（OD260甲-OD260乙）×80×稀釋倍數×5。
將誘變後獲得的酶活為5157u/毫升一株菌株在麥芽汁斜面中進行30代轉接培養，經測定酶活高仍達5000u/毫升，將該桔青黴菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2014。
對此菌株進行三級放大發酵培養，驗證其大規模工業化套用價值。
一級種培養：將保藏號為CGMCC No.2014的桔青黴菌進行斜面培養，斜面孢子用生理鹽水洗下接入三角瓶中，在無菌狀態下接入發酵罐中，種子培養基為葡萄糖40克/升，蛋白腖4克/升，磷酸二氫鉀0.06克/升，磷酸氫二鉀0.06克/升，硫酸鎂0.06克/升，氯化鈣0.04克/升，pH5～7，種子罐為30升外循環氣升式發酵罐，培養溫度28～30℃，罐壓1.0～1.5兆帕，通氣量3.0～5.0立方米/時，培養時間28～32小時。
二級種子培養：經上一級發酵的孢子用無菌壓縮空氣壓入發酵罐中，本級培養基為葡萄糖40克/升，蛋白腖4克/升，磷酸二氫鉀0.06克/升，磷酸氫二鉀0.06克/升，硫酸鎂0.06克/升，氯化鈣0.04克/升，pH5～7，二級種子罐為300升外循環氣升式發酵罐，培養溫度28～30℃，罐壓1.0～2.0兆帕，通氣量20～25立方米/時，培養時間28～32小時。
發酵工序：經第二級種子罐發酵的孢子用無菌壓縮空氣壓入發酵罐中，本級培養基為葡萄糖40克/升，蛋白腖4克/升，磷酸二氫鉀0.06克/升，磷酸氫二鉀0.06克/升，硫酸鎂0.06克/升，氯化鈣0.04克/升，pH5～7，發酵罐為3噸外循環氣升式發酵罐，培養溫度28～32℃，罐壓2.0～3.0兆帕，通氣量70～80立方米/時，培養時間28～32小時。
發酵培養到達終點後，測定酶活為5800u/毫升。說明該桔青黴菌株在3噸發酵水平發酵，所產的核酸酶P1的酶活仍能保持較高水平，具有大規模工業化套用價值。
榮譽表彰
2011年，《一株高產核酸酶P1的桔青黴菌及其選育方法》獲得第七屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
