《piggyBac轉座子介導的弓形蟲速殖子-緩殖子轉換分子機制研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由劉全擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：piggyBac轉座子介導的弓形蟲速殖子-緩殖子轉換分子機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：劉全
- 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
弓形蟲作為一種重要的人獸共患寄生蟲，侵入機體後，從速殖子轉變為緩殖子，逃避宿主免疫系統和藥物的攻擊；當機體免疫功能受損時，緩殖子轉變為速殖子，引起急性感染。弓形蟲速殖子-緩殖子轉換分子機制研究對於弓形蟲病防控具有重要意義。piggyBac轉座子是來源於鱗翅目昆蟲的DNA轉座子，作為一種基因誘變工具，具有轉座效率高、負載容量大、宿主特異性差等特點。本研究擬構建弓形蟲速殖子、緩殖子特異性表達蛋白SAG1、BAG1調控元件控制的報告基因GFP、RFP表達盒，串聯後構建弓形蟲piggyBac轉座系統，鑑定其弓形蟲體內的轉座特性；建立弓形蟲突變體克隆，體外誘導緩殖子，運用螢光顯微鏡篩選緩殖子形成缺陷或減弱突變體，通過反向PCR技術確定piggyBac轉座子的插入位點，確定弓形蟲速殖子-緩殖子轉換相關分子，闡述弓形蟲速殖子-緩殖子轉換的分子機制，為弓形蟲藥物治療及疫苗研製提供新的靶標奠定基礎。
結題摘要
本研究運用PCR及分子克隆技術獲得了弓形蟲速殖子、緩殖子特異性表達蛋白SAG1、BAG1的啟動子序列和多聚腺苷酸信號序列，構建速殖子特異性報告基因表達盒pSAG-RFP-GRA，piggyBac轉座子表達載體PB/SAG-RFP-GRA、pPB-DHFR-RFP和pPB-CAT，以及表達轉座酶的輔助質粒pSAG-Pbase-GRA。將轉座子表達載體pPB/SAG-RFP-GRA和輔助質粒Toxo-PBase通過電穿孔共轉染弓形蟲滋養體，通過流式細胞儀檢測，表明輔助質粒Toxo-PBase能明顯增強轉座子表達載體PB-Toxo-RED的轉染效率（70%），而表達載體PB-Toxo-RED轉染效率僅40%。證實piggyBac轉座子能明顯提高弓形蟲轉染效率，在弓形蟲體內具有轉座活性。將轉座子表達載體pPB-DHFR-RFP和pPB-CAT分別與輔助質粒Toxo-PBase共轉染弓形蟲，通過抗性篩選及有限稀釋獲得單克隆蟲體，經反向PCR及序列分析，表明piggyBac轉座子插入弓形蟲基因組並非TTAA特徵序列，可能是依賴於藥物的選擇壓力而隨機整合入基因組。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是細胞內的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，在細胞增殖、分化等過程中起重要作用。本研究通過螢光定量RT-PCR技術證實弓形蟲GT1株在不同緩殖子誘導條件下（鹼性、溫度）MAPK1的表達量明顯增高，鹼性誘導條件下MAPK1表達量約是溫度誘導條件的10倍，提示MAPK1是一種與應激相關蛋白，參與速殖子-緩殖子轉化基因表達的調節。以CAT為篩選標記構建弓形蟲MAPK1打靶載體，轉染弓形蟲後，經CAT篩選、有限稀釋獲得單克隆蟲體，經PCR、RT-PCR及Southern blotting鑑定，獲得弓形蟲MAPK1缺失株。通過螢光定量RT-PCR檢測，表明弓形蟲MAPK1缺失株在不同緩殖子誘導條件下，緩殖子特異性表達蛋白BAG1的表達量與GT1株有顯著差異，明顯低於GT1株，進一步證實弓形蟲MAPK1參與速殖子向緩殖子的轉化，可能成為弓形蟲藥物治療及疫苗研製的新靶點。通過上述研究，獲教育部自然科學一等獎1項，吉林省自然科學學術成果一等獎1項，專利授權1項，發表SCI論文11篇，培養研究生2名。
