microRNA非病毒納米傳遞系統構建及其促進體細胞重編程研究

《microRNA非病毒納米傳遞系統構建及其促進體細胞重編程研究》是依託江蘇大學，由徐希明擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：microRNA非病毒納米傳遞系統構建及其促進體細胞重編程研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：徐希明
• 依託單位：江蘇大學

項目摘要

本項研究重在構建基於陽離子化多糖-磷酸鈣混雜納米粒的三維納米基因傳遞系統，並藉此實現微核糖核酸（microRNAs）的高效傳遞和多能幹細胞的安全誘導。主要內容包括： 以miR-302及miR-302-367簇為對象、黏附性能好的陽離子多糖為材料，製備miR-混雜納米粒，研究其高效傳遞機理；構建三維納米支架；RT-PCR測定RNA在三維體系中的表達水平、持續時間；探尋二維、三維體系中重編程速度、效率與RNA表達水平、作用時間等影響因素之間的相關關係；分別檢測ES細胞標誌分子、全能基因和三胚層分化基因表達、體內三胚層分化能力評價iPS細胞的多能性；分析基因譜中癌基因表達變化以考察iPS細胞的安全性；研究microRNAs對NR2F2基因、TGFβ2通路的抑制，探討其促進體細胞重編程的機理。本項研究可為microRNAs高效傳遞、iPS細胞安全誘導提供新載體、新方法。

結題摘要

以提高iPS細胞的安全性和體細胞重編程效率為目標，以非致癌基因miRNA替代c-Myc，利用陽離子化多糖-磷酸鈣混雜納米粒，構建安全、高效miRNA 非病毒納米傳遞系統。主要內容：1. 以miR-302及miR-302-367簇為對象、黏附性能好的陽離子化杏鮑菇多糖為材料，製備了粒徑在30~50 nm的miRNA-陽離子化天然多糖-磷酸鈣混雜納米粒；2. 對miRNA轉導性能與混雜納米粒體細胞轉運機制進行研究，考察了針對不同細胞攝入途徑的抑制劑對納米粒入胞行為的影響，結果表明：miRNA混雜納米粒主要通過由格線蛋白和陷穴小泡介導的內吞途徑進入體細胞，並通過內涵體-溶酶體系統對進入細胞內的納米粒進行基因轉運和釋放；3. 製備了直徑為100nm～2μm、疏鬆多孔的三維納米支架，納米粒均勻分布在支架上，三維納米支架為粘附於支架上的細胞轉染提供了良好的環境；4. 研究了miRNA在二維和三維體系中的表達水平、持續時間及影響因素，結果表明：不同納米粒及其用量、細胞數量、培養基的配方、轉染次數、支架黏附性能均影響miRNA的表達水平和持續時間，可以實現對miRNA轉染效率和持續時間的定量調控；5. 考察了二維和三維體系中miRNA介導的體細胞重編程速度、效率及影響因素，結果表明：在二維和三維體系中，影響轉染效率的因素都影響重編程效率，與二維體系相比，三維納米支架的重編程效率顯著增加；6. 對iPS細胞的多能性與安全性進行了評價，將miRNA-多糖-磷酸鈣混雜納米粒轉染人源臍帶間充質幹細胞HUMSCs，對形成的iPS克隆進行多能性鑑定，結果表明：所形成的iPS具有多能幹性及分化為三胚層細胞的潛能；通過對miRNA介導形成的iPS進行基因晶片分析，與Yamanaka因子形成的iPS細胞相比，miRNA介導形成的iPS細胞中，ROS1、CRLF1、BCL2L2等癌基因表達下調，KLF10、SOX30、PDGFRA等抑癌基因表達上調，說明miRNA介導形成的iPS細胞具有安全性；7. 研究了miRNA對NR2F2基因、TGFβ2受體的作用，探討了miRNA介導的體細胞重編程機理，結果表明：miRNA通過抑制NR2F2基因表達，從而抑制TGF-β2受體的活化，促進體細胞重編程；miRNA也可以直接抑制TGFβ2受體的活性，下調smad2/3和psmad2/3的表達，促進體細胞重編程。