yep叫做附加體型質粒，又稱游離型質粒(yeast episomal plasmids或yeast extrachromosomal plasmid)，是一種具有代表性的酵母克隆載體。yep是一種罕見的真核細胞質粒，一般由大腸桿菌質粒、2μm質粒以及酵母染色體的選擇標記構成，屬自主複製型質粒。2μm質粒是釀酒酵母一個長度為2μm的內源質粒。
基本介紹
- 中文名：附加體型質粒
- 外文名：yeast extrachromosomal plasmid
- 別稱：游離型質粒
- 縮寫：yep
- 本質：酵母克隆載體
- 質粒類型：一種罕見的真核細胞質粒
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酵母
YEps是一種罕見的真核細胞質粒，一般由大腸桿菌質粒、2μm質粒以及酵母染色體的選擇標記構成，屬自主複製型質粒。2μm質粒是釀酒酵母一個長度為2μm的內源質粒。它的DNA分子通常與蛋白質結合構成複合物。2 μm質粒含有自主複製起始區(ori)和STB區，STB序列能夠使質粒在供體細胞中維持穩定。利用2μm質粒，人們已經構建出許多YEp型載體。YEp型載體PYF92由酵母的2μm質粒、pBR322質粒和酵母His3+(組氨酸)基因構成的。YEps對酵母細胞具有很高的轉化活性，一般為103～105轉化子/μg DNA。它在細胞內的拷貝數為70～200個。
YEps比YRp型質粒更穩定，性質和細菌質粒載體非常相似，惟一不同的是轉化細胞的篩選方法。YEp與YIp的主要區別是多一個2μm質粒上的複製原點，因此具有在酵母菌細胞內自主複製的能力。使用YEps時，主要通過受體細胞營養要求的變化鑑別轉化細胞與受體細胞。由於利用YEps克隆的基因容易在細胞繼代培養過程中丟失，因而，人們常用YIps替代YEps。不過，作為酵母菌的克隆載體，YIps的轉化頻率很低。
構建
釀酒酵母基因組上每隔30～40 kb便有一個ARS，因此用不含複製子結構的整合型質粒構建酵母染色體DNA基因文庫，很容易克隆到ARS片段。ARS能使重組質粒的轉化效率大幅度提高，但提高程度差別很大。來自同一酵母菌種的絕大多數ARS不能交叉雜交，但ARS序列中AT鹼基對的含量都很高(70%～85%)，並存在著一個拷貝的核心保守序列：(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)。這個核心序列改變一對鹼基，均可導致複製功能喪失。
但核心序列並不是進行複製功能的最小單位，其上游和下游鄰近區域的存在也是必需的。在一般情況下，具有完整自主複製功能的ARS大小在0.8～1.5 kb內。酵母自主複製型載體質粒的構建主要包括引入複製子結構、選擇標記基因、克隆位點三部分DNA序列。複製子結構的來源有兩種，即直接克隆宿主染色體DNA上的ARS或選用2μ質粒的複製子。由染色體ARS構成的質粒稱為YRp(圖1)，而由2μ質粒構建的雜合質粒為YEp(圖1)。YRp和YEp質粒在轉化釀酒酵母后，都能進行自主複製，拷貝數最高時可達200/個細胞。但轉化子經過幾代培養後，質粒的丟失率高達50%～70%，其主要原因是質粒的複製拷貝不能在母細胞和子細胞中均勻分配，而且這種不均勻分配現象發生的強度與質粒的拷貝數呈高度正相關。在麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)和脂解雅氏酵母(Yarrowia lipolytica)中．YRp型的質粒在每個細胞中只有2～5個拷貝，但卻顯示出較高的穩定性。有些YRp質粒在二倍體細胞中比在單倍體細胞中更為穩定，但其拷貝數比在單倍體細胞中減少5～10倍。
酵母質粒載體
酵母質粒載體是基因表達載體的一種，既可以在大腸桿菌中、又可以在酵母系統中進行複製與擴增，所以也稱為穿梭載體。它分為整合載體和自我複製載體兩類。①整合載體：它帶有一個酵母URA3標誌基因和大腸桿菌的複製和報告基因。由於質粒DNA與酵母基因組DNA之間發生了同源重組，在轉化的細胞中可以檢測到質粒的整合複製。整合載體中的YIp載體(yeast integrating plasmid)的轉化效率低，而且不穩定；②自我複製載體：該類載體在酵母中可以自我複製，主要有YRp(yeast replication plasmid)、YEp(yeast extrachromosomal plasmid)和YCp(yeast centromere plasmid)。YRp在遺傳學方面極不穩定；YEp可以很快與酵母內源質粒重組，重組後YEp載體很快複製並擴增。YCp質粒的遺傳特性是拷貝數少且遺傳性穩定；③釀酒酵母載體系統：釀酒酵母在基因工程技術操作中，作為克隆宿主或作為調節表達序列(如RNA聚合酶識別位點及核糖體識別位點)的克隆載體，其套用廣泛。在酵母細胞核中某些自我複製型質粒(如大腸桿菌質粒)也能獲得高拷貝。如在酵母中最大限度的表達基因，需要特異的啟動子，如乙醇脫氫酶、同工酶一1、磷酸甘油激酶、酸性磷酸酶和α因子等基因的啟動子等。通過DNA重組技術，還可以利用釀酒酵母生產外源蛋白。B型肝炎疫苗就是利用酵母為宿主得到的第一種醫用蛋白，另外組織型血纖維蛋白溶源激活因子、胰島素和水蛭素等蛋白質產品也是利用酵母為宿主細胞生產的。
在實驗方案設計中由於釀酒酵母不能對真核內含子進行識別和處理，因而外源基因須使用cDNA，產物蛋白是在胞內表達還是向外分泌也是十分重要的，因為這關係到基因工程下游工程的工藝設計。採用釀酒酵母表達系統還要注意選擇適當的啟動子和終止子；考查表達盒的穩定性；針對外源蛋白質積累部位的不同，採取相應的處理步驟；還要注意提高產量。
