《X,Y精子轉錄組和蛋白質組基因差異表達研究》是王棟、朱化彬、陳曉麗、郝海生、吳承疆於2010年10月30日編制的科技報告。
基本介紹
- 中文名：X,Y精子轉錄組和蛋白質組基因差異表達研究
- 作者：王棟、朱化彬、陳曉麗、郝海生、吳承疆
- 編制時間：2010年10月30日
- 報告類型：最終報告
內容摘要
考慮到性控凍精的成本和本研究所需要性控精液的巨大數量，本課題首先利用牛鮮凍精子差異蛋白及cDNA 差異表達分析技術建立了差異蛋白和cDNA檢測分析技術方法，並在此基礎上進行了X、Y精子差異蛋白和差異cDNA檢測分析研究，並對差異表達研究從mRNA和蛋白水平進行了分析驗證。簡述如下： 依據GenBank收錄的牛Y特異序列、常染色體序和牙釉基因序列分別設計引物，建立了單精子雙重PCR和單重PCR性別鑑定技術，對性控精液進行純度檢測，然後建立了穩定的精子細胞裂解方法，以鮮凍精子作為實驗材料進行了mRNA差異表達分析。經過抑制消減雜交，共獲得了一個含有1608個單一克隆的消減文庫，在正庫、反庫中各隨機挑取300個克隆進行測序，並採用晶片技術進行雜交驗證、生物信息學分析及螢光定量PCR分析，鑑定出19個陽性差異表達基因。採用雙向電泳技術進行了鮮凍精子差異蛋白表達分析，在冷凍、新鮮精子圖譜中分別得到839±34、464±12個蛋白點，經過軟體分析找到152個差異蛋白點，T檢驗後有45個蛋白點差異顯著，但經過人工驗證分析後最終確定的差異表達蛋白點有31個。凍精表達上調的有10個，表達下調的有1個，丟失的有20個。經蛋白酶解消化和質譜鑑定，最終獲得了3個差異蛋白點的質譜信息。在建立了差異蛋白分析平台基礎上，取9頭荷斯坦種公牛精液利用X、Y精子分離儀進行精子分離和純度分析，然後各建3個X精子和3個Y精子池，採用熱TRIzol法裂解精子細胞製備精子全蛋白。雙向電泳後採用ImageMasterTM2D Platinum version 6.0軟體進行圖譜分析得到42個X、Y精子差異蛋白。差異蛋白點經過酶解鑑定後，運用MALDI-TOF、MALDI-TOF-TOF與LTQ等質譜鑑定，最終發現了16個蛋白在X、Y精子間差異表達，並且這些蛋白與精子能量代謝、應激、蛋白酶活性和蛋白骨架等相關。此外，在進行的X、Y精子cDNA差異表達分析研究中，建立了cDNA抑制消減雜交文庫，在正反文庫中共獲得1111條有效序列，經測序和拼接後，X-Y文庫獲得Unigenes89條（28 singlets和61 contigs），Y-X文庫獲得Unigenes114條（55 singlets和59 contigs）。將克隆樣品進行晶片點制、雜交及數據採集，經過差異分析共找到42個在X、Y精子中差異表達的陽性克隆，有4個在Y精子中表達上調，有38個在X精子中表達上調。
