TMEM8B-a蛋白在肺癌細胞中降解的分子機制研究

項目摘要

TMEM8B基因是一個與腫瘤的轉移的抑制性基因。我們研究發現：TMEM8B基因存在兩個蛋白亞型，其中TMEM8B-a蛋白在肺癌中表達下調。將TMEM8B-a基因轉染至肺癌細胞，TMEM8B- a蛋白經過蛋白酶體降解，但卻不被泛素化。因此，我們認為在肺癌細胞內TMEM8B-a蛋白可能經過一種新的途徑降解，在細胞內可能還存在一種新的蛋白分子其作用和泛素分子相似，可以多聚化修飾目的蛋白，並將其帶入蛋白酶體降解。為了證實假說，我們採用了免疫沉澱、真核表達加親和純化的方法純，純化TMEM8B-a蛋白；並用LTQ質譜鑑定TMEM8B-a蛋白被修飾分子；採用構建缺失突變體的方法明確TMEM8B-a蛋白降解和多聚化修飾的關鍵結構域，並初步研究TMEM8B-a對肺癌細胞惡性行為的影響。這為闡述肺癌的發生髮展機制提供了新的實驗證據；更為重要的是對蛋白質降解的分子機制提出了新的補充和新的觀點。

結題摘要

TMEM8B-a蛋白是一個與腫瘤轉移相關的蛋白。前期研究表明，TMEM8B-a蛋白在結腸癌和鼻咽癌中表達下調，並和腫瘤侵襲轉移密切相關。在本項目的前期研究中我們發現：TMEM8B-a蛋白在肺癌活檢組織以及肺癌細胞系中表達下調；將TMEM8B-a基因穩定轉染至A549和H520細胞中，Western Blot檢測不到TMEM8B-a蛋白的表達，即TMEM8B-a不能在蛋白水平正常表達，但用real-time PCR 檢測卻發現TMEM8B-a的mRNA水平上調20倍以上。使用蛋白酶體抑制劑MG-132處理穩定轉染細胞後，Western Blot即可檢測出TMEM8B-a蛋白的表達，且表達水平隨著MG-132濃度的增高而增高。同時，免疫螢光技術檢測也發現，10μmol以上濃度的MG-132處理穩定轉染細胞24小時可以看到細胞中有螢光出現，且螢光強度隨MG-132濃度的增高而增強。同時免疫沉澱實驗結果表明TMEM8B-a蛋白在肺癌細胞內不依賴於泛素化的，經蛋白酶體的降解，但是確實又被某種分子多聚化修飾。在本項目的研究中，我們使用免疫沉澱技術和親和純化技術分別純化了TMEM8B-a蛋白，對TMEM8B-a蛋白進行質譜分析發現TMEM8B-a蛋白結合了HSP70蛋白，被HSP70蛋白修飾。但是免疫共沉澱實驗反向驗證過程中發現HSP70蛋白有可能結合免疫球蛋白，對實驗結果造成影響。在進一步實驗中我們證實了細胞膜漿連線蛋白Ezrin和TMEM8B-a有互動作用，並且Ezrin介導了TMEM8B-a的降解。隨後我們成功構建了TMEM8B-a以及Ezrin各個突變體，免疫沉澱實驗證實了7跨膜區結構域是TMEM8B-a降解的關鍵部位；Ezrin的N-ERMAD(1-296 aa)是介導TMEM8B-a蛋白降解的關鍵部位；TMEM8B-a的228-273AA部位是和Ezrin結合的關鍵部位；而TMEM8B-a的274-472AA是蛋白酶降解的關鍵部位。細胞實驗表明Ezrin介導TMEM8B-a的降解可以促進腫瘤細胞的運動和侵襲能力，TMEM8B-a的突變體CO可以不被Ezrin降解從而明顯抑制腫瘤細胞的運動和侵襲能力。

TMEM8B-a蛋白在肺癌細胞中降解的分子機制研究

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