TAp73和DNp73在苯並(a)芘誘導的DNA損傷應激反應中的作用機制研究

《TAp73和DNp73在苯並(a)芘誘導的DNA損傷應激反應中的作用機制研究》是依託杭州師範大學，由姜英擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：TAp73和DNp73在苯並(a)芘誘導的DNA損傷應激反應中的作用機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：姜英
• 依託單位：杭州師範大學

項目摘要

BaP可誘發細胞產生多種DNA損傷應激反應(DNA damage response, DDR)。已知抑癌基因p53參與了BaP誘導的DDR。p73是p53家族成員，其異常表達也與BaP的暴露有密切聯繫。p73功能相互制約的兩類異構體TAp73和DNp73的表達變化在腫瘤的發生於發展中發揮了關鍵作用，但其在DDR中的作用機制還不明確，且與已知DDR中關鍵因子的相互關係也有待闡明。因此，本研究分別以p53正常的L-02細胞和p53缺失的Hep3B細胞為靶細胞，建立BaP致DNA損傷的實驗模型，通過siRNA、免疫螢光和流式細胞術等一系列細胞分子生物學技術，對比性研究在不同遺傳背景下TAp73和DNp73對BaP誘發的DDR的影響，以及與已知DDR相關信號通路的互動作用。根據以上研究明確p73介導的p53非依賴性信號通路在BaP致DDR中的調控機理，為在分子水平闡明BaP的致癌機制提供科學依據。

結題摘要

BaP可誘發細胞產生多種DNA損傷應激反應(DNA damage response, DDR)。已知抑癌基因p53參與了BaP誘導的DDR。p73是p53家族成員，其異常表達也與BaP的暴露有密切聯繫。p73功能相互制約的兩類異構體TAp73和DNp73的表達變化在腫瘤的發生於發展中發揮了關鍵作用，但其在DDR中的作用機制還不明確，且與已知DDR中關鍵因子的相互關係也有待闡明。本研究先以p53正常的L-02細胞和p53缺失的Hep3B細胞為靶細胞，選用多個濃度的BaP處理以上細胞，在不同暴露時點，通過Real-time PCR和MTT試驗檢測胞內CYP1A1 mRNA誘導水平和細胞活力變化，確定了後續實驗BaP的濃度範圍（10 μM、20 μM、40 μM、80 μM和160 μM）和暴露時點（12 h和24 h），並且證實，在以上暴露時點內Hep3B細胞和L0-2細胞DNA損傷水平的明顯加重。在以上基礎上，通過質粒共轉染（雙質粒轉染），構建了TAp73、DNp73高表達Hep3B細胞（即Hep3BTAp73/DNp73細胞），通過MTT和彗星試驗，確定了BaP在Hep3BTAp73/DNp73細胞中的有效作用濃度範圍為：0 μM、10 μM、20 μM、40 μM和80 μM。通過流式細胞術和western blotting技術證實BaP誘導的Hep3BTAp73/DNp73細胞凋亡是線粒體依賴性的細胞凋亡。結合國內外最新研究進展，在以上建立的BaP誘導的Hep3B細胞凋亡模型中，通過western blotting和siRNA干擾技術進一步檢測了BaP對MDM2及其下游靶基因IAP-3的相對變化，初步證實TAp73通過下調MDM2進而抑制凋亡抑制基因IAP-3的表達，誘導細胞凋亡。