《T(brachyury)基因點突變致脊柱側凸的分子機制研究》是依託復旦大學，由楊雪艷擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：T(brachyury)基因點突變致脊柱側凸的分子機制研究
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：楊雪艷
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
脊柱側凸是一種具有家族聚集性傾向的疾病，其遺傳模式複雜多樣。在我們研究中發現了一個包括12名患者的常染色體顯性遺傳脊柱側凸家系，通過連鎖分析定位其致病基因為T brachyury基因。T基因編碼一種T-box家族轉錄因子。T基因突變可導致脊柱側凸之前從未見報導過。但T基因集中於胚胎髮育期的脊索中表達，脊索對於脊柱和體節的生成起著重要的引導作用。因此T基因突變很可能是因為對下游靶基因的調控發生變化從而引起脊柱發育異常。凝膠阻滯電泳和表面等離子共振實驗均顯示該家系中的T（Q199R）突變顯著增強了T基因與DNA的結合能力。因此本研究擬採用CRISPR/Cas9技術通過同源重組構建T（Q199R）小鼠模型，模擬人類脊柱側凸發病過程，通過分子、細胞、模式動物等不同水平的功能研究揭示出T基因突變導致脊柱側凸的作用機制，深化對家族性脊柱側凸發病機理的認識。
結題摘要
T基因（T, brachyury）是T-box轉錄因子家族最早被發現的成員，一直以來被認為是中胚層發育的分子標誌，在多種模式生物，例如小鼠、斑馬魚、爪蟾中都進行了深入的功能研究。近年來有報導，它的拷貝數重複與家族性脊索瘤易感性相關。然而它與人類疾病的相關性目前仍沒有遺傳證據確鑿的相關報導。 在本項目的研究中，我們發現一個包含4代人，15名患者的常染色體顯性遺傳大家系，通過連鎖定位和測序驗證發現該家系的致病基為T c.595A＞G，p Q199R雜合突變。該研究首次指出T基因的點突變可以引起人類脊椎發育異常，具體表現為頸椎C2-C3融合、胸椎側彎、下腰椎骶化、骶尾椎缺失。通過CRISPR/Cas9基因敲入小鼠進一步證實該表型的確是由家系中患者攜帶的Q199R突變引起，雜合小鼠僅有輕微的尾部彎折表型，純合小鼠尾椎缺失，腰骶椎縱向劈裂，多數死於出生前，即使能夠存活也會在出生後二十天內死亡。通過對野生型和突變小鼠的表達譜分析，我們發現有66個基因顯著上調，77個基因顯著下調，其中與脊椎發育相關的Ift140，Tbx6和Msgn1顯著上調，Pax1則顯著下調。 由於Q199R突變位點在物種之間極為保守，而且位於T蛋白的DNA結合區域和核定位區域，因此我們通過EMSA和SPR研究發現，T Q199R突變導致T蛋白對於DNA的結合能力顯著增強，但是融合蛋白亞細胞定位和核質分離Western實驗顯示該突變並不影響蛋白的核定位。進一步的 luciferase實驗表明其對於下游靶基因的轉錄活性明顯降低，結合T蛋白是以二聚體形式發揮作用，我們推測該突變可能是以顯性負效應的方式發揮作用。 通過該研究揭示了脊椎發育過程中相關轉錄因子網路的作用，深化了我們對於T基因功能及其致病分子機理的認識，有助於臨床對於相似症狀家族性疾病病因的鑑定與診斷。
