Notch信號負調節因子在牙根發育啟動中的作用研究

中文摘要

有關牙根再生和牙根發育機制的研究已逐漸成為牙齒再生研究領域的熱點，然而目前牙根發育啟動的分子機制並不清楚。已有研究證實，上皮性的Notch信號和間質中FGF10信號對於牙齒髮育維持牙冠模式狀態具有關鍵作用，但仍不清楚發育狀態如何進入牙根模式。本課題前期研究新發現了一種Notch信號負調節因子（SEL1L）分別在牙根模式和牙冠模式發育中的表達具有顯著性差異，因而推測其對牙根發育啟動具有關鍵作用。為了明確其在牙根發育啟動中的作用機制，本課題將採用SEL1L剪下體克隆、體外牙胚培養、慢病毒RNA干擾和過表達等技術，分別在器官、細胞、蛋白和核酸水平研究SEL1L對牙根啟動的影響和作用機制，闡明其在Notch-TGFβ-FGF10信號系統中的竄擾(crosstalk)功能，為牙根發育啟動機制和牙根再生研究提供實驗依據和理論基礎。

結題摘要

前期研究發現了Notch信號負調節因子在“牙根模式”和“牙冠模式”發育中的表達具有顯著性差異，證明了其對牙根發育啟動具有關鍵作用。在本課題資助下，為了明確Notch信號負調節因子在牙根發育啟動中的作用機制，本課題設計並完成了以下課題研究：採用上皮細胞分離培養，免疫組織化學染色，基因過表達等技術，分別在器官、細胞、蛋白和核酸水平研究SEL1L對牙根啟動的影響和作用機制進行了研究。進行了小鼠頸環細胞、上皮根鞘細胞和牙乳頭細胞的分離培養，對細胞進行鑑定，同時構建抑制SEL1L表達的RNAi載體和SEL1L表達載體，並對轉染效果和抑制效率進行鑑定。研究結果表明：1.成功建立了牙源性上皮的分離培養方法，使其可以滿足實驗要求。本方法已經申請國家發明專利（名稱：改良組織塊法培養嚙齒類動物切牙頸環上皮細胞的方法，申請號：201210100046.1）；2.成功構建了針對Sel1L基因的RNA干擾載體和過表達載體，通過RT-PCR及Western Blot對轉染前後的細胞進行對比檢測，發現所構建的載體可以有效的抑制或者增強牙源上皮細胞中Sel1L基因的表達。2.SEL1L基因可能通過抑制NOTCH信號、促進TGFβ信號、抑制牙胚細胞增殖、促進牙胚細胞凋亡和分化而影響牙根發育；2.過Sel1L基因的RNA干擾載體成功轉染體外培養的大鼠牙胚細胞，發現Sel1L基因阻斷後細胞增殖活性增強，分裂相增加，證明Sel1L基因對細胞的增殖具有一定抑制作用，同時Sel1L基因阻斷後細胞凋亡水平降低，說明Sel1L基因對細胞凋亡有一定的促進作用； RT-PCR及Real-time PCR方法檢測發現牙胚細胞中Sel1L被阻斷後，Notch信號的靶基因Hes1表達明顯上調,證明在體外培養的牙胚細胞中，Sel1L可以有效的抑制Notch信號表達，進而影響細胞的分化和增殖；Western blot方法檢測發現Sel1L基因被阻斷後細胞中信號分子Smad4表達水平顯著下降（與Sel1L的活性具有一致性），推測Sel1L可能參與了TGFβ信號通路而發揮作用,同時Sel1L基因被阻斷後體外培養的牙胚細胞中DSPP蛋白表達沒有顯著性變化，因而推測Sel1L基因可能並不直接影響、調節DSPP的表達， Sel1L基因促進細胞分化的作用可能存在許多其它的代償通路。本課題成果如下：1.研究共培養碩士研究生1名，並獲得碩士學

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