《NSP4在輪狀病毒致鼠膽管損傷中的作用及機理研究》是依託華中科技大學，由馮傑雄擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：NSP4在輪狀病毒致鼠膽管損傷中的作用及機理研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：馮傑雄
- 依託單位：華中科技大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
我們以前的研究發現非結構蛋白4（NSP4）在輪狀病毒致膽道閉鎖中起重要作用，但其機理不明。本課題擬用輪狀病毒的NSP4注射正常和CD8+淋巴細胞剔除新生鼠，分析新生鼠膽管損傷的程度及觀察致敏CD8+淋巴細胞對膽管上皮細胞的殺傷作用，直接證實CD8+淋巴細胞在NSP4致膽管上皮細胞損傷中的作用。同時採用生物信息學的方法預測NSP4若干CTL表位，合成這些表位肽，並注射至新生鼠，獲取肝臟及脾臟中CD8+淋巴細胞，然後觀察致敏CD8+淋巴細胞對膽管上皮細胞的殺傷效應，同時採用酶聯免疫斑點試驗和胞內細胞因子染色檢測淋巴細胞IFN-γ表達，了解致敏CD8+淋巴細胞的CTL活性，從而確定NSP4 中的CTL表位。通過以上研究，有望首次明確NSP4引起膽管損傷的機理，為通過免疫干預降低膽道閉鎖的發生奠定基礎。
結題摘要
我們以前的研究發現非結構蛋白4（NSP4）在輪狀病毒（RRV）致膽道閉鎖中起重要作用，但其機理不明。本研究對NSP4及其表位肽導致膽管損傷的機制進行進一步研究並明確其CTL表位。本課題對出生後12小時內的新生鼠腹腔注射表達純化的NSP4及固相多肽合成法合成的表位肽，第7天行HE染色觀察肝外膽管的損傷程度，並於腹腔注射後第7、14天用酶聯免疫斑點法檢測肝臟淋巴細胞釋放的IFN-γ，胞內細胞因子染色法檢測肝臟CD8+淋巴細胞釋放的IFN-γ，ELISA法檢測外周血清IFN-γ的含量，流式細胞術檢測記憶CD8+淋巴細胞，用乳酸脫氫酶釋放法檢測CD8+淋巴細胞對培養的肝外膽管上皮細胞(感染RRV與未感染RRV組)的殺傷程度，並研究TLR所起的作用及剔除CD8+淋巴細胞後肝臟淋巴細胞及外周血清釋放IFN-γ的情況，同時用表達純化的NSP4及合成的表位肽和佐劑腹腔注射孕鼠後再對其新生鼠腹腔注射RRV，於7天后行HE染色觀察小鼠肝外膽管的損傷程度及膽道閉鎖的發生率。實驗結果發現NSP4可導致小鼠肝外膽管發生部分梗阻，酶聯免疫斑點、胞內細胞因子染色、外周血清ELISA檢測到NSP4組及表位肽NSP4157-170和NSP4144-152組釋放的IFN-γ含量大於對照組（P＜0.05），細胞殺傷實驗結果表明NSP4組及表位肽NSP4157-170和NSP4144-152組的CD8+淋巴細胞對膽管上皮細的殺傷效應明顯強於對照組（P＜0.05），且對感染了RRV的肝外膽管上皮細胞的殺傷效應強於未感染RRV組；TLR2/4在膽管損傷中均起作用，剔除CD8+T淋巴細胞後肝臟淋巴細胞及外周血清釋放的IFN-γ含量明顯降低（P＜0.05），孕鼠腹腔注射NSP4及表位肽和佐劑後的新生鼠腹腔注射RRV後膽道閉鎖發生率明顯降低。本研究表明輪狀病毒NSP4介導的CD8+T淋巴細胞引起的細胞免疫反應在膽管損傷中具有重要作用，其中表位肽NSP4157-170和NSP4144-152可能是輪狀病毒NSP4的CTL表位。
