基本介紹
- 中文名：下一代病理技術
- 外文名：NGP
next-generation diagnostic pathology - 提出者：卞修武
下一代診斷病理學在腫瘤領域並非新事物，自2015年“精準醫療”理念提出後就開始隨著基因組學時代萌芽並迅速發展，誕生了大批腫瘤NGS企業。如今，隨著多組學研究和腫瘤免疫微環境（TME）研究的臨床價值深入人心，腫瘤精準診斷正在從NGS向以多重螢光免疫組化（mIHC）技術為代表的下一代病理技術（NGP）發展。
多重螢光免疫組化技術，基於酪胺信號放大（TSA）原理可以在一張組織切片中進行多種標誌物染色。通過各標誌物的在細胞上的單表達或者共表達，識別不同細胞亞群。結合人工智慧軟體，將病理醫生的局部判讀轉為客觀算法，擴展到全片進行定量計算，統計各個組織區域中細胞類型、密度，空間位置關係等信息。
該技術有三大技術突破：
NGP
一、多標記染色，解決了染色環節的抗體來源衝突的問題，實現5-9種標誌物的染色；
二、多光譜成像，解決了掃描成像環節的串色干擾問題，提高了圖片的信噪比；
三、智慧型圖像分析，解決了圖像分析環節的定量分析標準化的問題，實現全片定量分析。
多標記染色
酪胺信號放大（TSA）技術是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶抗原進行高密度原位標記的檢測方法。帶有染料標記的底物酪胺（T）分子在過氧化氫氧化環境下，被抗體或探針固定的 HRP 轉化為具有短暫活性的中間狀態（T*），然後被激活的中間態分子（T*）迅速與相接蛋白分子的富含電子區域（酪氨酸殘基）進行穩定的共價結合，未被標記的酪胺分子將被洗脫，實現對抗原的特異性染色。相接的蛋白（包括 HRP，抗體，目標抗原）都含有大量的酪氨酸結合位點，目標抗原處會富集大量標記分子，因此實現信號放大。
多標記染色技術利用 TSA 染色中酪胺分子與其結合的抗原蛋白之間共價鍵的穩定性，其鍵能遠高於抗原、抗體間的非共價鍵結合力，通過微波加熱法就可以在保留抗原標記信號的同時去除結合在抗原上的一抗和二抗分子，實現抗原的直接標記。後續可以再次使用同一種屬來源的抗體標記其他抗原靶點，只需更換不同的標記顏色，而不必考慮上一輪抗體的交叉干擾，在每輪染色中間的洗脫環節只需去除抗體，不需要對抗原上的標記進行徹底洗脫，對樣本的損傷會更小，同時解決了多標記免疫組織化學染色中抗體種屬選擇的限制。經由多標記染色的多種抗原標記物可以在樣本上同時存在，同時拍攝檢測記錄在同一張圖像畫面上，而無需後期對不同畫面進行加工對齊，這樣就保證了標記物間定位的準確性和穩定性。
多光譜成像
多光譜成像是檢測複雜染色樣品信號的有效手段，不僅能對混雜的各色信號進行識別，而且能夠去除自發螢光的干擾，其最大的特色在於圖像光譜信息的採集，同時提供生物組織樣本的形態結構和光學圖譜兩方面的信息。採用液晶可調諧濾波器（LCTF）以20nm的步進在420~720nm 可見光範圍內的進行光譜掃描，各波段採集的高解析度圖像被相機完整的記錄併合為一體。因此光譜圖像中的任何一個像素點都包含著一段完整的光譜曲線，每一種染料（包括自發螢光）也都有其對應的特徵光譜。利用樣品標記中的已知染料光譜，就可以將各色信號從多光譜圖像中拆分出來，變成富含光密度信息的獨立單通道圖像。
光譜成像在組織學分析中具有其獨特的技術優勢。對於明場免疫組織化學染色樣品，藉助多光譜成像可以對混雜的染料進行有效的識別、拆分和定量，即使是顏色相近的 DAB（棕色）或 PermaRed（紅色）染料也能被拆分開來，並實現精準的定量。對於多標記免疫螢光染色的樣品，藉助多光譜成像技術可以對多達十色復染的信號進行準確拆分，獲得清晰的、無串擾的、高清晰圖單通道圖像。同樣經光譜記錄的螢光染色樣品圖像，也可以轉變為傳統 HE 或免疫組織化學樣式的明場效果圖便於形態結構的辨識和病理觀察。
智慧型圖像分析
智慧型圖像分析軟體將智慧型組織識別算法與光譜解讀和多標記分析融為一體。利用光譜和多色標記提供的豐富信息，軟體可以通過圈選-訓練的方式自學習，將病理醫生/專家的判讀經驗轉變為客觀算法，還可以對細胞中表達的特定蛋白進行量化評分。藉助特異的細胞標記物可以對組織微環境中的不同細胞進行標識，再通過光譜採集和信號拆分，得到不同細胞表型的圖像。
智慧型圖像分析軟體首先根據核標記（DAPI）信號對組織中的細胞進行識別，並進一步的對胞漿、胞膜進行分割，然後根據不同細胞中相應標記物信號強度和形態特徵以訓練學習的方式將其歸屬為不同的細胞類群。還可以對不同蛋白在特定細胞、特定部位上的表達強度進行定量測定，給出免疫組織化學評分結果，或者是共定位表達的比例。由此就在組織原位完成了組織識別、細胞識別、細胞分型的精準識別，將過去在流式細胞儀上才能實現的細胞分型統計與組織形態學有機的結合在一起，實現了組織微環境的完整描繪。
研究現狀
多重螢光免疫組化技術在腫瘤學、神經科學、幹細胞研究、器官移植、罕見病及免疫性疾病、新冠疫苗、新藥研發及伴隨診斷等領域都有重要的套用場景和研究價值，已經成為研究熱點技術。
多重螢光免疫組化技術可大幅提高檢測靈敏度，檢測低豐度樣品，實現對患者腫瘤免疫分型全面、客觀地分析，基於多重螢光免疫組化技術的腫瘤微環境檢測，能夠更深入地了解腫瘤的發生機制，更有可能預測腫瘤對治療的反應，精準篩查免疫治療獲益人群。2018年諾貝爾生理學獎得主、免疫學家James P Alison素來推崇多重螢光免疫組化技術在腫瘤免疫微環境研究中的套用，在乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等領域都發表了重磅成果。
隨著多重螢光免疫組化技術在基礎和臨床研究中的不斷套用，越來越多用於評估抗PD-1/PD-L1藥物的預測性生物標誌物將被發現。例如2020年在《Nature》期刊上連發三篇關於三級淋巴結構（TLS）在黑色素瘤、腎癌和肉瘤中的免疫治療領域的研究，共同認為：TLS與免疫治療的預後密切相關，甚至患者能否能從抗PD-1免疫治療中獲益，可能也取決於TLS的浸潤情況。此外，2021年在《Nature Cancer》期刊上發表的研究探索了TLS狀態與免疫治療應答率、PFS和OS的關係，探究PD-L1表達水平、CD8+T細胞密度與TLS狀態的關係。採用多重免疫組化技術結合CD8、CD20、CD21和CD23等標記物判斷TLS成熟度，進而系統定量分析腫瘤間質和T細胞浸潤，研究表明CD8+T細胞的高浸潤與TLS的存在可獨立於PD-L1表達，用於預測PD-1抑制劑的療效，輔助篩選PD-L1表達陰性的獲益人群。
展望
多重螢光免疫組化技術大幅提高了組織形態學分析的數據精度和準確度，不僅滿足了現代組織學分析在數據客觀性、精確性方面的更高要求，更是從方法學角度為組織學研究帶來了革命性的變化，為描繪複雜的組織微環境提供了的全新的思路，必將為下一代診斷病理學的蓬勃發展提供新的契機。
