《NAD+在DNA損傷引起的細胞死亡中的作用及其機制研究》是依託四川大學，由尹耕擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：NAD+在DNA損傷引起的細胞死亡中的作用及其機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：尹耕
- 依託單位：四川大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
細胞死亡異常是自身免疫病臟器損傷的主要原因。目前公認的Okamoto學說認為：損傷引起細胞DNA鏈斷裂，進而激活PARP以NAD+為底物進行修復，PARP過度激活導致NAD+耗竭，細胞在合成NAD+的過程中因能量衰竭而死亡。CD38表達於各種細胞，底物也是NAD+。CD38通過消耗NAD+調控細胞內外NAD+水平。研究證明CD38基因敲除小鼠臟器與血清內NAD+水平明顯升高。依照Okamoto學說，CD38基因敲除後，NAD+水平增高，損傷刺激下細胞死亡應該減少，但我們的預實驗發現CD38基因敲除後雖然NAD+水平增高，細胞死亡反而增加，說明細胞內補充NAD+並不能挽救DNA損傷引起的細胞死亡。本課題將利用CD38基因敲除小鼠MEF細胞深入研究NAD+在損傷導致細胞死亡過程中的意義，探尋細胞死亡非NAD+途徑的信號通路，進而為研究自身免疫病發病機制，尋找干預自身免疫病的新靶點提供理論依據。
結題摘要
本實驗利用CD38-KO小鼠和相同基因背景WT小鼠進行實驗，在確定CD38-KO為純合子基因型小鼠後，首先測定MEF細胞內NAD+水平，結果發現CD38-KO MEF細胞內NAD+水平明顯高於WT；用0.4mM濃度H2O2刺激後發現CD38-KO組NAD+水平仍然明顯高於WT。再用多種濃度H2O2刺激兩組細胞死亡，發現CD38-KO MEF細胞死亡數量均較WT明顯增加。上述結果提示CD38-KO MEF細胞內NAD+水平在受到DNA損傷刺激時是增高的，按照Okamoto學說應該推論出CD38-KO組NAD+較WT組更不易耗竭，細胞死亡數量應該較WT組少，但實驗結果卻相反，發現CD38-KO組細胞死亡較WT組明顯增加。由此，我們推測DNA損傷所致細胞死亡的原因並非NAD+耗竭，NAD+在DNA損傷所致的細胞死亡中不扮演重要角色。繼而，採用不同濃度 H2O2刺激下CD38-KO和WT MEF細胞內PARP活性測定，以及加用PARP抑制劑DPQ後不同濃度H2O2刺激細胞死亡實驗。結果發現CD38-KO和WT細胞內PARP活性隨著H2O2濃度的遞增而增高；CD38-KO 的PARP活性，在各H2O2濃度組均較WT高。加用DPQ後CD38-KO在各濃度H2O2組細胞死亡數量均分別較無DPQ刺激時明顯減少。結果提示DNA損傷刺激越強，PARP活性越強，細胞死亡數量越多；加用DPQ後，PARP活性減少，細胞死亡數量明顯減少。由此可見，PARP激活與細胞死亡密切相關。最後，測定0.4mM H2O2刺激下CD38-KO和WT MEF細胞內重要抗凋亡分子pAKT-ser473和BCL-xl水平，發現pAKT-Ser473在CD38-KO組表達明顯弱於WT組，BCL-xl在兩組間表達差異無統計學意義。加DPQ後，pAKT-Ser473在CD38-KO組表達較不加DPQ時明顯增加，加DPQ後，pAKT-Ser473在CD38-KO組和WT組表達差異無統計學差異，BCL-xl在CD38-KO和WT組加DPQ前後均無明顯變化。上述結果提示H2O2刺激下PARP過度激活後通過下調抗凋亡分子pAKT-Ser473的表達來促進細胞凋亡，而不通過調節抗凋亡分子BCL-xl的表達來調控凋亡。
