《HSP70-HTNV 重組病毒樣顆粒誘導特異性抗漢灘病毒免疫的研究》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由李靜擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：HSP70-HTNV 重組病毒樣顆粒誘導特異性抗漢灘病毒免疫的研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：李靜
- 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
現有滅活疫苗對降低腎綜合徵出血熱（HFRS）發病率起到重要作用，但其本身還存在一些不足。病毒樣顆粒（VLPs）是一種不含病毒核酸的空殼結構，與天然病毒顆粒結構相似，可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細胞，有效地誘導機體產生免疫應答。研究表明VLP疫苗具有長期的保護作用，免疫效率高，其效果優於滅活疫苗,可能成為未來疫苗的發展方向。文獻報導漢坦病毒GP，NP可以在體外自主形成VLP，但未見其免疫動物的相關後續報導，可能與VLP的表達量低、穩定性差或免疫原性弱有關。我們以往研究表明，HSP70-HTNV NP融合蛋白可以增強誘導特異性細胞和體液免疫反應，其中HSP70發揮著重要作用。本課題擬利用昆蟲-桿狀病毒表達HSP70,HTNV S,HTNV M基因全長，觀察其組裝成病毒樣顆粒的情況及其特點，並用以免疫小鼠，研究其誘導小鼠產生的 HTNV 特異性免疫保護反應，為HFRS的防治提供實驗基礎。
結題摘要
病毒樣顆粒（VLPs）是一種不含病毒核酸的空殼結構，與天然病毒顆粒結構相似，可通過與病毒感染相同的途徑呈遞給免疫細胞，有效地誘導機體產生免疫應答。本課題利用昆蟲-桿狀病毒共表達 HSP70、漢坦病毒 G1、G2、S 基因全長，觀察其組裝成病毒樣顆粒的特點，並研究其誘導小鼠產生HTNV NP的特異性免疫反應。研究內容主要包括以下幾個部分： 1、桿狀病毒表達載體的構建及鑑定。構建桿狀病毒表達質粒pFastBac-G1, pFastBac-G2, pFastBac-S和pFastBac-HSP70，通過酶切、測序及 PCR 鑑定，並在DH10Bac中通過藍白篩選實現轉座，獲得重組Bacmid DNA。 2、在昆蟲細胞 Tn5 中共表達質粒 G1, G2, S和HSP70，通過SDS-PAGE, Western Blot驗證其表達效果，結果顯示重組蛋白主要存在細胞培養上清中，電鏡證實病毒樣顆粒的形成。 3、建立表達HTNV S基因的B16細胞。構建pcNDA3.1/S 真核表達載體，轉染B16細胞，通過G418進行穩定篩選，分別從DNA，mRNA和蛋白水平檢測HTNVS的表達。 4、純化HTNV-VLP蛋白誘導抗HTNV NP的研究。間接ELSA結果表明，HTNV-VLP免疫的小鼠血清中，抗HTNV-NP的抗體水平明顯升高(P＜0.01)，以IgG2a升高為主，IgG2a/lgG1比值升高P(＜0.01)，提示體液免疫反應有從Th2型向Thl型轉化的趨勢。體液免疫反應的增強所產生的抗體具有交叉免疫的特點，可同時識別HTNV 76-118株、SEOV L99株以及體外原核、真核細胞表達的HTNV NP；INF-γELISPOT檢測結果表明，HTNV-VLP免疫小鼠脾淋巴細胞中針對B16-NP的特異性T細胞數量顯著增加 (P＜0.01)； LDH 釋放實驗檢測脾淋巴細胞毒性，結果表明，HTNV-VLP免疫的小鼠脾淋巴細胞可以顯著增加對B16-NP細胞的殺傷效果(P<0.01)，但對B16細胞的殺傷效果沒有顯著的影響 (P>0.05)。我們的研究結果表明，在昆蟲桿狀病毒系統中，HSP70與漢坦病毒 G1、G2、S 基因可以共表達形成病毒樣顆粒（HTNV-VLP），增強誘導 HTNV NP 特異性細胞免疫和體液免疫反應，其中HSP70 發揮著重要作用。
