《HBHA蛋白對AECⅡ細胞自噬抑制作用的機制研究》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由楊柳擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：HBHA蛋白對AECⅡ細胞自噬抑制作用的機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：楊柳
- 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
HBHA是結核菌早期感染與播散過程中的重要毒力分子。在感染上皮細胞時表達明顯增強，缺失表達的結核菌則黏附和感染能力顯著下降。但目前其介導感染和播散的生物學效應機理尚未完全明確。本課題組已證實肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬可防禦結核分枝桿菌感染；並發現HBHA除了已知的黏附作用外，還具有抑制AECⅡ細胞自噬的作用，因此，HBHA可能是通過黏附和抑制自噬兩種機制介導結核分枝桿菌的感染與播散。基於上述研究基礎，本課題擬進一步明確HBHA蛋白的功能，通過構建不同的缺失突變體證明其抑制自噬的結構域，鑑定HBHA與自噬體相互作用的信號通路和靶分子，闡明該抑制作用對結核感染和播散的影響，探討自然免疫機制抵抗HBHA介導的感染的作用，為研製針對HBHA蛋白的疫苗和以之為靶點開發抑制性藥物奠定基礎。
結題摘要
HBHA蛋白是結核菌早期感染和播散的一個重要的毒力因子。為了闡明HBHA蛋白在結核菌播散過程與自噬作用的分子機制，本研究首先表達純化了重組HBHA蛋白，並提取了天然HBHA，製備了抗HBHA多克隆抗體；以自噬抑制劑3-MA和 RNAi方法抑制細胞自噬功能，探討自噬在結核菌感染中的作用；觀察了HBHA對肺泡II型上皮細胞A549自噬的影響；繼而研究了HBHA在結核菌引起的A549細胞壞死過程的作用；原核表達HBHA-△C、 HBHA-△N和HBHA-△α螺旋區蛋白，研究參與抑制自噬作用的HBHA結構域；並構建表達了HBHA缺失的分枝桿菌，觀察△HBHA與AECⅡ自噬體的相互作用；對IL-1β、IL-6、IL-19、TNF-α和IFN-γ五種細胞因子釋放量做了檢測，通過高通量shRNA技術篩選出HBHA介導炎性反應的炎性信號通路。結果顯示，A549細胞自噬的抑制可以導致結核菌引起的細胞壞死程度增強；HBHA可以抑制細胞自噬的成熟，使得自噬相關蛋白LC3表達減低；缺失N端或C端的HBHA不能發揮對LC3的抑制作用，HBHA發揮抑制自噬作用的活性結構域為α螺旋區；HBHA引起的A549細胞自噬抑制可以增強結核菌引起的細胞壞死；抗HBHA抗體可以在一定程度上抑制結核菌引起的A549細胞壞死，缺失了HBHA的菌株作用後LC3的表達無變化，而野生型的菌株作用後LC3的表達量會隨濃度增加下調。從而證明，HBHA具有抑制細胞自噬的功能，在結核菌引起細胞壞死並播散過程中發揮著重要作用。因此，HBHA作為一種潛在的疫苗，具有重要的套用價值。
