《FAAP在小鼠附睪中的功能和作用的分子機制研究》是依託山東師範大學，由丁乃崢擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：FAAP在小鼠附睪中的功能和作用的分子機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：丁乃崢
- 依託單位：山東師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
粘著斑相關蛋白（FAAP）是一個在進化上保守、能夠一步連線2'3'-環磷酸基和5'-羥基末端的RNA連線酶，生理功能尚不完全清楚。FAAP基因表達經RNAi下調後，小鼠胎兒期致死，線蟲胚後發育緩慢，且雄性生殖系統發育異常；我們前期研究亦發現，FAAP在附睪起始段特異性高表達，並受睪丸因子調節。為了確定FAAP在雄性生殖系統中的功能，本項目擬進一步深入研究FAAP在小鼠附睪中的功能和作用的分子機理、及其在起始段高表達的分子機制。包括製備定向敲除附睪起始段中FAAP基因表達的小鼠，檢測其對精子成熟和附睪發育的影響；確定其在附睪中是否通過與ARE相互作用，調節某些含ARE並與精子成熟相關基因mRNA的穩定性；研究附睪細胞中FAAP表達水平改變後，XBP1及其調節的基因表達變化，探索其在UPS中的作用；確定附睪起始段中PEA3對FAAP的表達調節。本項目的完成有助於揭示FAAP在附睪中的生理功能。
結題摘要
FAAP是目前後生動物中唯一已知的RNA連線酶，能完成2′,3′-環磷酸酯和5′-羥基末端的連線。其在tRNA和Xbp1 mRNA剪接中起連線作用，但生理功能尚不清楚。本項目研究結果顯示，PEA3 對FAAP基因表達沒有直接調節作用，另外，FAAP並沒有通過ARE區影響mRNA的穩定性。為深入研究該基因在附睪中的功能，我們採用幹細胞囊胚注射方法構建了帶LoxP位點的FAAP基因條件敲除鼠，並通過Defb41iCre/wt工具鼠在附睪頭將FAAP基因靶向敲除，發現小鼠附睪頭靶向敲除FAAP基因後導致雄性不育。敲除鼠從出生後到8周齡附睪發育形態正常，11、13和16周齡附睪形態出現異常；由於小鼠個體差異及敲除效果的不同，精子在附睪的不同部位發生堵塞，其中在輸出管和近端附睪頭髮生精子堵塞造成附睪分區紊亂、起始段高柱狀細胞完全消失、睪丸生精上皮變薄；當精子堵塞發生在附睪體或附睪尾時，起始段高柱狀上皮變矮或差異不明顯。FAAP敲除鼠附睪尾分離的精子數量急劇減少，大量精子聚集，活力下降，90%的精子頭尾分離或尾部鞭毛形成髮夾結構。敲除雄鼠與野生型雌鼠可以正常交配形成陰道栓，但無後代產生，輸卵管內發現老化和異常分裂的卵母細胞，無二細胞胚胎。通過實時定量RT-PCR檢測發現，敲除鼠附睪中一些對精子成熟和運動起重要作用的基因表達顯著下調，如Xbp1、Grp78、Ros1、Esr1/2、Gpr64、Defb42、Lcn5、Lcn8、Cst8、Gpx5、Cldn10-b、Etv5和Actg2。其中，Xbp1、Ros1，Esr1/2和Gpr64等基因的mRNA剪下體也發生顯著改變。Ros1，Esr1/2以及Gpr64敲除鼠雄性不育，FAAP敲除鼠表型與他們非常相似，這些基因敲除鼠附睪中Defb42、Lcn5、Lcn8、Cst8、Gpx5、Cldn10-b和Actg2基因表達也顯著下調。由此得出結論：在FAAP敲除鼠中，Xbp1、Gpr64和Esr1/2及其下游基因的下調，影響了附睪上皮細胞的重吸收功能，造成附睪腔微環境的改變，使精子轉運受阻；Ros1和Actg2的下調，引起附睪起始段上皮高度的改變，進而影響了精子在附睪的成熟。本項目的結果表明，FAAP可能是調節附睪精子成熟的關鍵“節點”基因，其通過控制Xbp1、Ros1，Esr1/2和Gpr64基因的剪接，影響精子在附睪中的成熟。
