《Calpain對心肌再灌注階段的線粒體自噬的調控機制》是依託上海交通大學，由虞敏擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：Calpain對心肌再灌注階段的線粒體自噬的調控機制
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：虞敏
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
線粒體損傷是心肌缺血/再灌注損傷(I/R)的重要環節，受損線粒體被以自噬方式隔離和降解，線粒體自噬是重要的內源性保護機制。我們在細胞實驗中發現，calpain（鈣依賴的半胱氨酸蛋白酶）加重 I/R損傷，與抑制線粒體自噬有關；且calpain活性上調時，參與線粒體自噬通路的關鍵蛋白Atg5和p62下調，但具體機制未明。新近研究發現線粒體自噬受到calpain的負向調控。推測calpain通過降解Atg5和p62而抑制線粒體自噬，使受損線粒體積累，導致I/R損傷。本項目擬在細胞實驗的基礎上，以siRNA、腺病毒基因轉染干預各關鍵蛋白的表達，以RT-PCR、Western blot、螢光探針、雷射共聚焦顯微鏡等檢測線粒體自噬及相應的線粒體功能的變化；體外I/R模型將套用心肌特異性calpain基因敲除小鼠，從整體層面探討calpain的調控機制。本項目有望為防治I/R提供新的思路和靶點。
結題摘要
本課題組建立乳鼠原代心肌細胞培養的缺氧/復氧（H/R）模型，實驗證明calpain在缺氧和復氧階段蛋白表達量和活性隨時間延長而上調，受到抑制劑干預而下調；同時細胞自噬隨缺氧時間延長而增強，抑制calpain使自噬流增強，並改善心肌酶釋放、活力下降、凋亡增加等心肌H/R損傷。基因沉默技術證明calpain1是起作用的亞型。Western Blot和RT-PCR提示H/R時自噬相關蛋白Atg5和p62的下調與calpain的激活有關，其他自噬相關蛋白如Atg7、Beclin1則不受calpain影響。進一步通過重組腺病毒轉染過表達Atg5和p62，發現Atg5過表達可增強H/R誘導的細胞自噬，但不產生細胞保護作用；過表達p62可增強自噬，同時增加細胞活力，減少凋亡，具有抗H/R損傷作用，p62可能是calpain作用的靶蛋白。P62是線粒體自噬的關鍵蛋白，而線粒體自噬能清除損傷線粒體，減少ROS產生和內源性凋亡。通過檢測線粒體外膜蛋白表達和細胞ROS水平，發現H/R時calpain激活可以抑制線粒體自噬，增加ROS產生，提示了calpain的作用機制。進一步建立小鼠在體心肌缺血/再灌注（I/R）模型，證實抑制calpain可增強心肌細胞自噬反應，改善心肌酶釋放、減少危險區的梗死面積、減少TUNEL染色陽性的凋亡細胞；同時抑制自噬可取消calpain抑制劑的保護作用，Western Blot和DHE檢測可見calpain引起p62降解和ROS增加，與細胞實驗表現一致。總之，本課題組證實心肌I/R引起calpain高表達和激活，降解自噬相關蛋白p62，抑制細胞巨自噬和線粒體自噬，引起ROS產生增加和細胞凋亡、壞死等，是calpain參與I/R損傷的作用機制。
