B肝病毒對DNA 複製應激沉默效應的研究

《B肝病毒對DNA 複製應激沉默效應的研究》是依託四川大學，由李明遠擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：B肝病毒對DNA 複製應激沉默效應的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李明遠
• 依託單位：四川大學

項目摘要

B肝病毒感染是原發性肝細胞癌（HCC）發生髮展的重要危險因素之一，B肝病毒的X基因（HBx）在其中發揮重要作用。HBx與基因轉錄、信號傳導、表觀遺傳和細胞周期等調控過程密切相關。現已知以DNA損傷應答為基礎的基因組監護機制在維持基因組穩定性，抑制突變積累和腫瘤發生過程中起到關鍵作用。我們已發現HBV能夠抑制ATR介導的DNA複製應激檢驗點通路，其早期回響信號蛋白TopBP1的磷酸化程度明顯減低，導致H2AX變體不能充分磷酸化，造成DNA複製叉不穩定和DNA雙鏈斷裂的產生。本研究將利用分子細胞生物學技術進一步闡明HBV及HBx蛋白干擾ATR通路早期激活和信號傳導的分子機制，及此沉默效應在HBV複製和致癌過程中的作用，探索並行干預多條DNA損傷應答通路後HBV陽性肝癌細胞對放化療的敏感性改變，以期為B肝後肝癌的治療提供全新的理論依據和策略。

結題摘要

本項目已圓滿完成了設計的研究內容，取得了有價值的研究成果，達到國內相同研究領域先進水平。研究結果證實了三個方面的學術問題：一是HBV能抑制UV引起的ATR通路的活化，削弱G2/M檢驗點功能，所造成的基因組不穩定與CENP-F定位無關。在喜樹鹼（CPT）引起的DNA損傷應答中，攜帶有HBV基因組的肝癌細胞2215的單鏈DNA形成存在缺陷，其機制是使單鏈結合蛋白RPA32磷酸化缺陷，無法募集相關DNA修復蛋白到損傷位點，從而阻斷ATR激活。二是在HepG2和293T細胞中過表達HBX，造成DNA損傷後RPA32，H2AX磷酸化均減弱，其機制是HBX通過與ATR信號通路早期蛋白Rad9分子相互作用，劫持Rad9功能，抑制RPA32磷酸化，從而抑制ATR激活。三是HBV能降低肝癌細胞對化療藥物的敏感性，在初步篩選出的殺傷HBV陽性肝癌細胞的DNA損傷應答通路的小分子探針中，效果最好的是CGK733（簡稱CK）。CK可增強HBV陽性肝癌細胞對紫杉醇的敏感性，增敏效率達2倍以上，其機制可能是CK能促進細胞快速通過紫杉醇引起G2/M期阻滯，導致有細胞絲分裂災變而引起死亡。 此外，我們擴展延伸研究的兩方面的實驗結果還表明：①smu1基因編碼的蛋白主要定位在細胞核，siRNA沉默smu1 基因表達後，細胞的生長增殖能力明顯缺陷，對各種基因毒性因素的處理（x-ray、UV、CPT及Etopside）更加敏感，標誌基因組損傷的γH2AX foci增多；用複製抑制劑HU及UV處理時，多個關鍵的DNA損傷反應（DDR）蛋白包括Chk1-S345, H2AX-S139, p53-S15及Cdc2 (Tyrosine 15)等過度表達，預示其細胞周期檢驗點過度活化，細胞凋亡亦顯著增加。本研究結果可能為HCC的治療提供了新靶點。②野生型p53激活劑Nutlin-3能使肝癌細胞DNA發生雙鏈損傷，同時發生細胞凋亡和細胞周期阻滯；促使肝癌細胞中的野生型p53從細胞核部分移位至細胞質，這種移位與p53-Ser392磷酸化水平降低有關，為HCC的分子治療提供了新的思路。