B型肝炎病毒基因分型檢測試劑技術審查指導原則

為加強醫療器械產品註冊工作的監督和指導，進一步提高註冊審查質量，國家食品藥品監督管理總局組織制定了《B型肝炎病毒基因分型檢測試劑技術審查指導原則》

本指導原則旨在指導註冊申請人對B型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）基因分型檢測試劑註冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評註冊申報資料提供參考。

本指導原則是對B型肝炎病毒基因分型定性檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，並依據產品的具體特性對註冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導性檔案，不涉及註冊審批等行政事項，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

基本介紹

• 中文名：B型肝炎病毒基因分型檢測試劑技術審查指導原則
• 發文時間：2015年7月15日
• 發文號：2015年第32號
• 發文機關：國家食品藥品監督管理總局

一、範圍

我國2006年B型肝炎流行病學調查表明，我國1—59歲一般人群B型肝炎表面抗原（HepatitisBsurfaceantigen，HBsAg）攜帶率為7.18%，5歲以下兒童的HBsAg僅為0.96%。據此推算，我國現有的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性B型肝炎患者約2000萬例；由於不同的B型肝炎病毒基因型對現有藥物治療可能存在不同的治療回響，B型肝炎病毒分型基因檢測在慢性B型肝炎患者治療中的作用正被越來越多人所關注。

根據HBV全基因序列異質性≥8%的界線，可將其分為不同的基因型。目前，已鑑定的HBV基因型有A—I九種，基因型與血清亞型之間的關係已被清晰論證。基因序列的單個核酸的變化即可能改變血清亞型，但血清亞型不能反映基因的差異。通過對HBV全序列分析發現，在不同基因型之間S區段異質性最大，而型內S區段的異質性最小，從而也可以根據S區基因序列異質性≥4%的標準區分不同的基因型。在此基礎上，發展了一系列簡單、準確的分型方法，推動了HBV基因型的流行病學及臨床相關研究。

基於現階段研究，在我國HBV以C型和B型為主。HBV基因型與疾病進展和干擾素α治療效果有關。與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現B型肝炎e抗原（hepatitisBeantigen，HBeAg）血清學轉換，較少進展為慢性肝炎、肝硬化和原發性肝細胞癌；並且HBeAg陽性患者對干擾素α治療的應答率高於C基因型；A基因型患者應答率高於D基因型。其他基因型與疾病譜的關係還未有特殊發現。但是，由於基因型分布不均衡和樣本大小的影響，還需要作多中心大樣本的研究方能進一步了解基因型與疾病譜之間的關係。
HBV基因型的分布具有明顯的地理學特點，大體上如下：

A基因型主要流行於美國及北歐國家；B和C基因型主要分布在亞洲及遠東地區；D基因型在世界各地均有發現,但主要分布於地中海地區；E基因型僅限於非洲；F基因型則分布在中美洲；G、H、I及J型基因型的地理分布尚不清楚。隨著時間的推移，新的基因型可能會被陸續發現。

HBV基因分型檢測試劑是指利用包括分子生物學相關方法在內的核酸檢測技術，以HBV基因序列為檢測靶標，對人血清、血漿等樣本中的HBV不同基因型進行體外定性檢測的試劑。結合臨床表現和其他實驗室指標，可作為B型肝炎感染者臨床診療的輔助指標之一。

本指導原則適用於基於實時螢光（polymerasechainreaction，PCR）方法的HBV基因分型檢測試劑，其他方法學的定性檢測方法可參照本指導原則，但應根據產品特性確定其中具體內容是否適用，如不適用，應另行選擇符合自身方法學特性的技術要求或評價方法。本指導原則適用於進行產品註冊和相關許可事項變更的產品。其他未盡事宜（包括產品風險分析資料等），應當符合《體外診斷試劑註冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規要求。

二、註冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及同類產品上市情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學及不同基因型檢出能力等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批准的同類產品之間的主要區別。若尚無同類產品批准上市，則應詳細對該產品的有效性及安全性進行論述，說明理論依據。

提交的資料應符合《辦法》和《關於公布體外診斷試劑註冊

申報資料要求和批准證明檔案格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）的相關要求。

（二）主要原材料研究資料

應提供主要原材料如引物、探針、企業參考品的選擇與來源、製備過程、質量分析和質控標準等相關研究資料。若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定，並提交工藝驗證報告；如主要原材料購自其他供貨商，應提供的資料包括：供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨後的質量檢驗資料。主要包括以下內容：

1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

2.PCR和組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、製備、質量標準及實驗研究資料，主要包括以下內容：

2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核苷酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩定性等的驗證資料。

2.2引物

由一定數量的鹼基構成的特定序列，通常採用（Deoxyribonucleicacid，DNA）合成儀人工合成，合成後經聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對分子量、純度、穩定性、功能性實驗等的驗證資料。如為外購，應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

2.3探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用於特定核酸序列的探測。合成後經聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化，在5’-端(和/或3’-端)進行標記，並經HPLC或其他適宜方法純化，純度應達到HPLC純。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如HPLC分析圖譜，應對探針的分子量及標記的螢光素進行核實，並進行功能性試驗驗證。

2.4酶

DNA聚合酶，應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩定性，如：94℃保溫1小時後仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性，應對酶活性有合理驗證。如使用其他工具酶，應提供其詳細的研究資料。

2.5核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無DNase和RNase污染。

2.6企業內部參考品及試劑內對照（質控品）：

由於B型肝炎病毒不易培養，製備相應的參考品及質控品時，參考品設定建議採用滅活病毒的血清/血漿。並且參考品及質控品與被測臨床樣本在整個試驗過程中應保持相同的檢測方式。

企業內部參考品以及質控品設定必須客觀合理，能夠充分評價產品的質量。應採用金標準或其他方法對企業內部參考品以及質控品中物質成分進行確認。

2.6.1陽性參考品及陽性質控品

陽性參考品應包含試劑盒所能檢測的所有基因型（所有的單基因型以及所有的重組基因型），每個基因型應設定不同濃度水平，應能滿足驗證產品性能的需要，至少設定兩個濃度水平（弱陽性、中或強陽性）；常見基因型（如B型、C型）陽性參考品設定建議採用滅活病毒的血清/血漿。其他基因型陽性參考品設定可採用模擬臨床樣本。對於陽性參考品的獲取方式建議使用金標準的方法或同類方法或者其他能證明問題的方法進行確認。

陽性質控品應包含目標靶基因，用於監控整個檢測過程，包括：核糖核酸提取，基因擴增和檢測。陽性質控品作為單獨檢測過程，用於模擬患者樣本，用於與患者樣本進行同時檢測。

2.6.2陰性參考品及陰性質控品

可採用經確認無目標靶基因的序列的樣本。陰性參考品及陰性質控品對照物可反映非特異擴增或檢測過程，當不存在目標序列時不會得到相關信號。陰性參考品設定建議採用滅活的血清/血漿。陰性質控品應參與樣本核酸的平行提取，對假陽性結果進行質量控制。

2.6.3靈敏度參考品（檢測限參考品）

靈敏度參考品是評價產品檢測能力的重要工具，對於定性產品來說，其設計的合理性顯得非常重要。在基因型設定方面，應包括試劑盒所包含的所有基因型。在濃度設定方面，應採用核酸定量的方法對該參考品進行定量檢測，明確被測物的具體量值，設定濃度應接近產品最低檢出限。

2.6.4精密度參考品

精密度參考品應反映產品檢測的重複性以及重複檢測的穩

定性，該部分參考品應採用臨床樣本作為精密度參考品，需包括陰性、弱陽性、中或強陽性三個濃度水平的精密度驗證。

2.6.5內對照（內標）

與目標靶基因平行提取，擴增；用於對檢測管內抑制物造成的假陰性結果進行質量控制。內對照（內標）可採用競爭性或非競爭性的引物設定。

2.6.6其他需要注意問題

如單個產品檢驗原理為兩種方法學或多種方法學聯合檢測的方法，應對產品中每種方法學均設定參考品及質控品，用於對不同方法學的質量監控，例如：檢測原理為PCR-雜交方法聯用，在這種情況下，不僅需在PCR環節設定參考品及質控品對擴增過程進行質量控制；同時在基因探針雜交環節也必須設定質控程式對雜交過程進行質量控制。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

基本生產工藝主要包括：配製工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配製工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配製過程應對pH、電導率等關鍵參數進行有效控制。

生產工藝研究的資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法、質控方法、穩定性和有效期，提供確切的依據，主要包括以下內容：

1.主要生產工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應原理介紹。

3.基因位點選擇、PCR方法學特性介紹。

4.DNA提取純化方法最佳化，建議包含純化步驟，內標、質控品均應全程參與提取純化，不建議採用煮沸法進行DNA提取。

5.確定最佳PCR反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量、加樣量及反應體積等。

6.確定PCR各階段溫度、時間及循環數的研究資料。

7.對於基線閾值（threshold）和閾值循環數（Ct）確定的研究資料。

8.不同適用機型的反應條件的對比分析，如果有差異應分別詳述。

如單個產品檢驗原理為兩種方法學或多種方法學聯合檢測的方法，例如：檢測原理為PCR方法和基因探針雜交方法聯用。應在上述1至8項基礎上完善以下工作：

1.主要生產工藝及反應原理介紹。

2.雜交膜條的製備工藝。

3.確定最佳雜交反應體系的研究資料，包括酶濃度、探針濃度、樣本量、加樣量及反應體積等。

4.確定雜交各階段溫度、時間的研究資料。

5.交叉污染和攜帶污染研究。

該類產品適用於檢測B型肝炎病毒感染人群，在臨床檢測中發現，部分臨床樣本會出現高濃度的B型肝炎病毒載量。這部分臨床樣本在提取過程中增加了交叉污染及攜帶污染的可能性。在核酸提取過程中，從而導致假陽性的結果。

如產品配套採用自動提取設備提取DNA，在攜帶污染試驗中，建議將高濃度陽性（病毒濃度至少不低於108IU/mL）樣本與陰性樣本在同一待提取反應板中連續交替排列並應進行不少於5輪上述提取研究。建議試驗使用的高陽性樣本水平應接近該產品檢測能力的上限。以鄰近高陽性樣本的陰性樣本的陰性結果對比未鄰近高陽性樣本的陰性結果，評估攜帶和交叉污染的影響。

如產品檢測原理中涉及開管檢測過程，如自動化膜條雜交儀，應參照該項要求進行驗證。

（四）分析性能評估資料

企業應提交在產品研製階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內控標準、實驗數據、統計分析等詳細資訊。如有相應的國家參考品，應在分析性能評估階段採用國家參考品對產品性能進行驗證。建議著重對以下分析性能進行研究：

1.陽性/陰性參考品符合率

所有基因型別的陽性參考品均應按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度的不同，應對各水平陽性參考品設定相應Ct值的限制；陰性參考品應按要求檢出為陰性。

2.最低檢測限（分析靈敏度）

建議採用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準，應明確各基因型的最低檢出限。申報試劑應在最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度對說明書描述的所有基因型進行驗證。

3.分析特異性

3.1交叉反應

用於HBVDNA分型檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：

3.1.1核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床症狀的其他病原體。

3.1.2申報產品中不同基因型以及B型肝炎病毒其他基因型對被檢測基因型的影響。對於難以獲得的基因型,可採用針對該基因型構建的質粒或其他基因工程產品進行交叉驗證。

3.1.3建議用高濃度的病原體對B型肝炎病毒核酸陰性樣本進行交叉反應的驗證。申請人應提供所有用於交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。

3.2干擾物質

潛在的干擾物質主要包括：內源性干擾物質和外源性干擾物質。

3.2.1內源性干擾物質：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等。

3.2.2外源性干擾物質：常用抗凝劑，臨床常用抗病毒藥物如：干擾素、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等對檢測結果的影響。

3.2.3建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質的干擾影響進行檢測。干擾物濃度的分布應覆蓋人體生理及病理狀態下可能出現的物質濃度。應註明不同干擾物質對被檢測物質無干擾的最高限值。對於不易收集的干擾物質濃度樣本可使用臨床模擬樣本進行調節。

4.精密度
精密度的評價方法並無統一的標準可依，可根據不同產品特徵或企業的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性。具體實驗方法可以參考相關的國外或國內有關體外診斷產品性能評估的檔案進行。企業應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異係數的範圍等。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求：

4.1用於精密度評價的樣本濃度水平應至少包含陰性、弱陽性和強陽性三個水平。

4.2合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續檢測，每天至少由2人完成不少於2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重複實驗以對室間精密度進行評價。

5.基因混合型的研究

該部分研究主要包括兩個目的：一是申報試劑檢測不同濃度混合型的能力。申請人應設定不同濃度比例的混合型進行驗證。二是申報試劑在判讀結果時，是否能夠有效區分基因重組型和基因混合型。申請人應設定不同濃度的基因重組型與不同混合比例的基因混合型進行驗證。

因理想的不同濃度比例基因混合型樣本在臨床單位中難以收集，申請人可以使用臨床模擬樣本進行驗證。該部分樣本建議用核酸測序明確樣本中包含的所有基因型序列，同時應使用核酸定量的方法確定不同基因型的濃度。

如申報產品的結果判讀無法有效區分基因混合型與基因重組型，應在產品說明書中進行註明。

6.HBV核酸分離純化

病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的重要因素之一。企業應對核酸提取的環節做詳細的驗證。

（五）陽性判斷值或參考區間確定資料

陽性判斷值確定資料主要指對核酸檢測的Ct值進行確認，建議申請人對申報產品用於結果判斷的臨界值予以確認。參考值範圍研究資料樣本來源應考慮不同年齡、型別、地域等因素，儘可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在參考值灰區，應提供灰區的確認資料。如採用其他方法對陽性判斷值進行確認研究，應說明這種方法的合理性。對於此類試劑，正常人群及其他患病人群中一般不應檢出HBV基因型。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性（有效期）、運輸穩定性、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對於實時穩定性研究，應提供至少3批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期後的研究資料。

應對樣本穩定性進行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度範圍內選擇溫度點（溫度範圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩定性。適於冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】項中進行詳細說明。

（七）臨床試驗

1.試驗方法

B型肝炎病毒基因分型核酸檢測試劑目前主要供臨床醫護人員對慢性B型肝炎患者設定臨床治療方案提供參考依據。隨著B型肝炎基因型與肝炎病情關係的研究工作不斷深入，研究方法不斷改進，新的研究成果可能將被轉化套用於臨床工作中。如B型肝炎病毒基因分型核酸檢測試劑用於新的臨床用途，應根據新的臨床用途特點設定具有針對性的臨床試驗研究方案。

參比方法的選擇可以考慮以下幾方面：

1.1如已有同類產品上市，可以選擇境內已批准上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為參比試劑，採用擬申報產品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產品等效或優於已上市產品。應充分考慮已上市同類試劑的型別選擇、靶序列選擇、分析靈敏度等特性，確保考核試劑與申報試劑具有明確可比性。

1.2申請人亦可採用核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗研究的參比方法，驗證考核試劑檢測結果與核酸序列測定（測序）結果之間的一致性情況。臨床試驗報告中應對選用的測序方法做詳細介紹。

申請人應提供以下關於測序部分的詳細試驗資料，需有臨床試驗單位簽章確認：

1.2.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

1.2.2測序方法所用引物相關信息，如基因區段選擇，分子量、純度、功能性實驗等資料。引物設計應合理涵蓋考核試劑擴增的靶核酸區段、位點、及所有突變類型。

1.2.3對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與申報試劑的相關性能進行適當比對分析。

1.2.4測序方法應建立合理的陽性質控品和陰性質控品對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。

1.2.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結果分析資料。

2.臨床試驗機構的選擇

臨床試驗機構應獲得國家食品藥品監督管理總局資質認可。建議申請人在選擇臨床試驗機構時，應考慮試驗機構之間的地域代表性，臨床試驗機構應具有分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節（儀器、試劑、質控及操作程式等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和對比試劑都應處於有效的質量控制下，最大限度保證實驗數據的準確性及可重複性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的方案。各臨床試驗機構的方案設定應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內並由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉試驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床試驗都應記錄在案，並明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應採用盲法以保證試驗結果的客觀性。各臨床試驗機構選用的對比試劑應一致，以便進行合理的統計學分析，同時方案中應明確寫明對於對比試驗研究中測定結果不符的樣本進行確認試驗的第三方試劑或方法。

4.臨床試驗對象選擇

4.1基因型方面的考慮

HBV病毒為DNA病毒，其基因具有顯著的多樣性，不同的地區和民族，HBV流行的基因型不同。境內流行的HBV基因型主要為B型、C型，部分地區存在少數D型，以及重組型基因B/C型，B/D型，C/D型等。而且，HBV基因型具有一定的地域差異，不同地區流行的HBV基因型也不盡相同。因此，在選擇HBV感染者病例時，首先應根據HBV流行的情況，選擇能代表我國不同地區流行基因型的HBV感染者病例，以對試劑檢測我國流行的HBV病毒的能力進行客觀科學的評價，選擇的基因型應包括上述三種主要的基因型。

4.2病例選擇及樣本類型

應涵蓋註冊申報試劑所聲稱的所有基因型，應選擇部分干擾樣本（交叉反應樣本），比較干擾組和病例組結果，以便對申報產品的臨床性能做出科學的分析。臨床試驗所需樣本總例數不少於500例，其干擾組例數的選擇以不超過總臨床樣本數的10%為宜。對於B型及C型基因型臨床樣本，應滿足每種基因型不少於200例臨床樣本；對於D型基因型及其他基因型臨床樣本，建議每種不少於30例陽性病例。每種基因型臨床樣本應來源於B型肝炎病毒核酸檢測陽性的患者。如註冊申報試劑中包含其他基因型，應結合這部分基因型在我國的流行病學特點，臨床套用情況等綜合因素，對其臨床有效性進行科學評估。

在樣本選擇時，應注重患者來源的不同地域性，不同病情進展，不同藥物治療方案等。對於干擾組樣本的選擇，應考慮到在檢測過程中容易產生干擾，可能造成假陽性/假陰性的情況，以從臨床角度考察其分析特異性。

5.統計學分析

對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，如檢測結果一致性分析、不同基因型陰性/陽性符合率等。對於本類產品對比試驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表χ2檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果有無明顯統計學差異。在臨床試驗方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。

6.結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對於兩種試劑的檢測結果有不一致的樣本，如有必要，應採用臨床上公認較好的第三種同類試劑或參考方法對結果進行確認，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可

能結果進行分析。

7.臨床試驗總結報告撰寫

根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求，臨床試驗總結報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，並應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述：

7.1臨床試驗總體設計及方案描述

7.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床試驗機構選擇、臨床試驗主要研究人員簡介等基本情況介紹；

7.1.2病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準；

7.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等；

7.1.4統計學方法、統計軟體、評價統計結果的標準。

7.2臨床試驗具體情況

7.2.1臨床試驗所用產品的名稱、批號、有效期及所用機型等信息，以及對比試驗產品的註冊情況；

7.2.2對各臨床試驗機構的病例數、年齡分布情況進行綜合分析，建議以列表或圖示方式給出具體例數及百分比；

7.2.3質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、質控品運行情況，對檢測精密度、質控品測量值的抽查結果評估；

7.2.4具體試驗過程，樣本檢測、數據收集、樣本長期保存、結果不一致樣本的校驗等。

7.3統計學分析

7.3.1數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改；

7.3.2陽性符合率、陰性符合率、總體符合率；

7.3.3以交叉多格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行多格表χ2檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性。應明確將每種基因型單獨進行統計。

7.4討論和結論

對總體結果進行總結性描述並簡要分析試驗結果，對本次臨床試驗有無特別說明，最後得出臨床試驗結論。

（八）產品技術要求

擬定產品技術要求應符合《辦法》和《體外診斷試劑註冊申報資料要求及說明》的相關規定。申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下,根據申請人產品研製、前期臨床評價等結果,依據國家標準、行業標準及有關文獻，按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的有關要求編寫。內容主要包含產品性能指標和檢驗方法。第三類產品技術要求中還應當以附錄形式明確主要原材料、生產工藝及半成品要求。

附錄中應將待測靶基因的基因位點、引物/探針設計及來源、參考品設定、來源及驗證情況、各種酶的來源、特性及驗證等重點內容予以明確。

B型肝炎病毒基因分型檢測試劑的產品技術要求應主要包括以下性能指標：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。陽性參考品主要考察對試劑盒覆蓋範圍內不同基因的檢測符合性，陰性參考品則重點對申報試劑的分析特異性進行驗證。

（九）註冊檢驗

根據《辦法》要求，首次申請註冊的第三類產品應該在國家食品藥品監督管理總局認可的、具有相應承檢範圍的醫療器械檢驗機構進行連續3個生產批次樣品的註冊檢驗。對於已經有國家標準品的檢測項目，在註冊檢驗時應採用相應的國家標準品進行檢驗；對於目前尚無國家標準品的項目，生產企業應建立自己的參考品體系並提供相應的內部參考品。

（十）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、標本採集及處理、實驗方法、檢驗結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，是體外診斷試劑註冊申報最重要的檔案之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求。境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應儘量保持與原文說明書的一致性，翻譯應準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的註冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規範格式對此內容進行標註，並單獨列明文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，明確乙

型肝炎病毒（HBV）基因分型檢測試劑說明書的重點內容，以指導註冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預期用途】

應至少包括以下內容：

1.1試劑盒用於體外定性檢測已明確為B型肝炎病毒核酸陽性患者的血清、血漿等樣本中B型肝炎病毒基因型。輔助醫療專業人員了解病人的B型肝炎病毒基因型感染情況以及確定適當的治療方法。

1.2B型肝炎病毒基因分型試劑的基因型應至少包括B型、C型、D型，如果申請人略去上述任意一種推薦的基因型，應給出合理的解釋。

1.3適用人群：確診的慢性B型肝炎病毒感染者。

1.4簡要介紹B型肝炎病毒基因型的特徵，包括不同基因型的特徵、不同基因型常見亞型、不同基因型在地域及人群中的分布情況、不同基因型在臨床的套用特點。

1.5強調該試劑盒檢測結果僅供臨床參考，不應作為治療藥物調整的唯一依據，臨床醫生應結合患者病情及其他實驗室檢測指標等因素對患者治療進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

2.1對試劑盒檢測能夠覆蓋的所有被檢測的基因型進行詳細描述（靶序列長度及來源區段、基因型類型及相關特徵等），對引物及探針設計簡介、不同樣品反應管組合、對照品設定及螢光信號檢測原理等進行逐項介紹。

2.2核酸提取純化的方法、原理等。

2.3試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理作適當介紹。

3.【主要組成成分】

3.1詳細說明試劑盒內各組分的名稱、數量、比例或濃度、穩定性等信息，陰性/陽性對照品（或質控品）可能含有生物源性物質的組分，應說明其生物學來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2試劑盒中如不包含該項檢測必需的組分，說明書中應列出相關試劑/耗材的名稱、註冊證號（如有）及其他相關信息。

3.3如果試劑盒中不包含用於核酸分離/純化的試劑組分，則應在此註明經驗證後推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產企業、產品名稱、註冊證號（如有）以及配套儀器等詳細信息。

4.【適用機型】

註明所有適用的儀器型號，並提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

5.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩定性、開封穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等，應標明具體的儲存條件及效期。

6.【樣本要求】

6.1樣本收集要求：如採集時間、採集順序等，是否受臨床症狀、用藥情況等因素的影響。結合臨床需要並參照慢性B型肝炎防治指南（現行版）相關要求。

6.2血液樣本應當說明對採血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、採血管和抗凝劑，其他樣本應說明樣本採集、處理及保存方式。

6.3樣本處理、運送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預處理、運送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復至室溫，凍融次數的要求。如有需要應對高於檢測範圍的樣本稀釋方法進行規定。

7.【檢驗方法】

詳細說明試驗操作的各個步驟：

7.1試劑準備及配製方法、注意事項。

7.2詳述待測樣本、質控品核酸提取的條件、步驟及注意事項。

7.3核酸提取/純化方法的詳細介紹。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5PCR各階段的溫度、時間設定、循環設定及相關注意事項。

7.6儀器設定：特殊參數、結合探針的螢光素標記情況對待測基因及內標的螢光通道選擇。

7.7基線、循環閾值（Ct值）的選擇方法。

8.【陽性判斷值或者參考區間】

該類產品用於定性檢測，Cut-off值是檢測試劑有效區分檢測結果陽性和陰性的標準，如產品檢測原理為螢光PCR法。Cut-off的描述包括基線的確定方法和循環閾值（Ct值）的要求。除Ct值要求外，對於接近Cut-off值的弱陽性結果或者接近Cut-off值的陰性結果建議結合擴增結果的S形曲線對結果進行判斷。

9.【檢驗結果的解釋】

結合陽性對照、陰性對照以及反應管中靶基因和內標的檢測結果（Ct值），對所有可能出現的結果組合及相應的解釋進行詳述。如存在檢測灰區，應對灰區結果的處理方式一併詳述。建議將不同結果的典型性圖譜納入說明書中，便於用戶對結果的讀取。

10.【檢驗方法的局限性】

10.1該產品僅用於B型肝炎病毒核酸檢測陽性患者的臨床樣本檢測。

10.2該產品僅用於不同基因型的定性檢測，不適用定量檢測。

10.3該產品未包含全部乙型基因型別。該產品僅用於產品說明書預期用途所包含的已知基因型的檢測，不適用其他基因型及未知基因型的檢測。因此，當本試劑盒檢測結果為陰性時，並不能排除被檢測者帶有B型肝炎病毒的其他基因位點。

10.4如申報產品因產品原理導致無法對B型肝炎病毒不同基因型混合樣本和重組型樣本進行區別，應在產品說明書中進行注釋，幫助醫療專業人員對檢測結果進行客觀認識。

10.5模板DNA質量將影響該產品檢測結果。模板DNA的質量可能受樣本來源、採集過程、運輸條件、樣本處理等因素影響，同時也受DNA提取方法、PCR儀類型、操作環境以及當前分子生物學技術的局限性等的限制，可能導致出現假陽性和假陰性的檢測結果。使用者須了解檢測過程中可能存在的潛在風險。

10.6該產品以B型肝炎病毒基因上的特定DNA片段為檢測靶標，如試劑盒引物與探針結合區出現基因突變，導致檢測結果異常，將影響檢測結果解釋。

11.【產品性能指標】

詳述以下性能指標：

11.1最低檢出限：說明試劑不同樣本類型及不同基因型的最低檢出限，簡要介紹最低檢出限的確定方法以及對最低檢出限驗證所採用的基因型。如不同基因型之間最低檢出限不同，應分別列出。

11.2精密度/重複性：精密度參考品的組分、濃度及評價標準、評價結果。

11.3特異性：

11.3.1交叉反應：

易產生交叉反應的其他病原體以及B型肝炎病毒其他基因型的驗證情況，建議以列表的方式表示經過交叉反應驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

11.3.2干擾物質：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響。

11.3.3藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結果的影響，如未進行相關研究也應提供相關警示說明。

11.3.4對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所採用的統計學方法及統計分析結果。

12.【注意事項】

應至少包括以下內容：

12.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在

感染性的警告。

12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規範執行。

三、名詞解釋

基因型：是指根據不同個體基因序列之間的規律性差異而分成的不同類型，用來描述基因本身的特徵。基因型分析可鑑定個體或病毒毒株之間的差異。

四、起草單位

國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心。