《AP-2γ基因在睪丸生殖細胞瘤發生中的分子作用機制研究》是依託湖南師範大學，由周暢擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：AP-2γ基因在睪丸生殖細胞瘤發生中的分子作用機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：周暢
- 依託單位：湖南師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
AP-2γ是睪丸腫瘤的特異表達的新分子標記，但迄今為止具體的遺傳分子機制還不清楚。前期運用CHIP的方法，鑑定到多個受AP-2γ調控的靶基因。通過對靶基因的啟動子區序列的分析，在其中6個基因的啟動子區發現了完整的AP-2γ結合位點核心序列。本項目擬採用CHIP-on-chip方法進一步篩選AP-2γ的下游調控網路；染色質免疫沉澱及報導基因構建等技術探討AP-2γ 是否通過與上述相關基因啟動子區的結合而直接調控其轉錄活性；並採用凝膠阻滯實驗、突變質粒構建、基因轉染、Western印記、supershift及免疫共沉澱等技術，研究AP-2γ在睪丸生殖細胞腫瘤發生過程中的誘導作用及可能參與的OCT4-SRY-KAP1複合體調控途徑的分子機制。本研究將闡明AP-2γ基因在睪丸生殖細胞腫瘤發生中的分子機制，對基因診斷並最終利用分子干預手段治療睪丸生殖細胞腫瘤相關疾病提供理論基礎。
結題摘要
AP-2γ基因是睪丸生殖細胞瘤發生的新分子標記。通過對AP-2γ基因進行生物信息學分析，發現在AP-2γ的上游啟動子區域有轉錄因子OCT-4和SRY的結合位點。通過ChIP-PCR實驗，我們首先證明OCT-4和SRY都能夠結合到AP-2γ的啟動子區域。螢光素酶實驗結果表明OCT-4能夠負調控AP-2γ轉錄活性，SRY正調控AP-2γ轉錄活性。下調OCT-4後AP-2γ的螢光素酶表達活性和蛋白水平均能上升；下調SRY表達，導致AP-2γ的螢光素酶表達活性和蛋白表達水平均下降；免疫螢光實驗表明，NTera-2細胞內中SRY和OCT-4蛋白分別與AP-2γ在細胞核中有共定位；構建小鼠的隱睪動物模型，我們發現正常小鼠睪丸中Oct-4高表達，AP-2γ低表達；而在小鼠隱睪中Oct-4低表達，AP-2γ卻表達上調。我們還證明SMAD4是AP-2γ的靶基因，AP-2γ負調控SMAD4基因的表達。 研究表明阿司匹林、薑黃素可誘導乳腺癌、肝癌等多種癌症細胞發生凋亡，但是二者在人類睪丸生殖細胞腫瘤治療方面的研究報導卻很少。在本研究中，我們通過Hoechst 33258染核、流式分析法等檢測阿司匹林或薑黃素對睪丸生殖腫瘤細胞株NTera-2的凋亡影響；採用MTT法檢測對NTera-2細胞增殖的影響。研究結果表明，阿司匹林處理後能夠促進NTera-2細胞的凋亡、抑制NTera-2細胞的增殖。Caspse8活性檢測顯示隨著阿司匹林的濃度增強caspase8活性增強；阿司匹林誘導後, Western blot檢測，FasL表達明顯下降， caspase8表達和活性上升都是劑量和時間依賴性的。caspase3前體的表達減少，表明其剪下體活性增強而使細胞凋亡。薑黃素處理NTera-2細胞後可以抑制其增殖並誘導細胞凋亡發生，而且這種細胞凋亡現象具有時間和劑量依賴性。不同劑量的薑黃素處理細胞後， Bcl-2在蛋白水平下降，同時Bax的表達上調，且Cyt-C，Caspase-9，Caspase-3，Caspase-8和PARP均被激活。AP-2γ的表達隨著薑黃素劑量增加呈現下降趨勢，且其蛋白降解是通過蛋白酶體途徑進行的。薑黃素誘導NTera-2細胞凋亡和抑制增殖是通過抑制AP-2γ蛋白調控的下游信號通路。
