AChE參與褐飛虱若蟲中腸細胞凋亡進程的研究

《AChE參與褐飛虱若蟲中腸細胞凋亡進程的研究》是依託湖北大學，由楊之帆擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：AChE參與褐飛虱若蟲中腸細胞凋亡進程的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：楊之帆
• 依託單位：湖北大學

項目摘要

褐飛虱是水稻的重要害蟲之一。褐飛虱若蟲中腸組織是其與水稻互作的重要界面，中腸組織存在發育過程的細胞凋亡現象，且抗性水稻能誘導凋亡加劇。乙醯膽鹼酯酶(AChE)的非經典功能之一是參與細胞凋亡進程。本課題首先通過原位催化研究AChE在I型褐飛虱4齡若蟲中腸凋亡細胞中的催化活性；並通過免疫組織化學法在中腸細胞中定位AChE；其次研究取食抗性水稻前後，飼餵amiRNA-AChE和amiRNA-IAP前後，中腸AChE表達變化，並檢測凋亡細胞數量變化；進一步研究參與凋亡進程的AChE分子類型及其亞細胞分布規律；最後利用酵母雙雜交尋找與AChE互作的蛋白，通過RNAi的方法驗證該蛋白與中腸細胞凋亡的關聯性，嘗試構建AChE參與的凋亡信號通路。研究結果將拓展人們對AChE參與褐飛虱中腸細胞凋亡進程，及其參與褐飛虱與水稻互作的新功能的認識，為培育抗性水稻新品種提供參考，為尋找新的治理方案提供線索。

結題摘要

褐飛虱是水稻的重要害蟲之一。AChE是害蟲體內農藥作用的重要靶標，也是調控細胞凋亡的重要因子。為了解AChE在調控褐飛虱中腸細胞凋亡，及其在褐飛虱與水稻互作中的作用，開展了以下研究：對生物型I和II褐飛虱的AChE進行測序，分析表明兩型AChE中均出現了鹼基的多態性替換，且因起始密碼領先導致I型AChE序列更長。構建了凋亡抑制基因IAP-2的原核表達載體Pet23a-IAP2，並在大腸桿菌BL21中實現了異源表達。製備了多克隆抗體，進行了抗體的特異性分析並確定了效價。克隆了細胞色素P450基因CYP6CW1和家蠅NADPH細胞色素P450還原酶(NCPR)基因，通過桿狀病毒表達系統實現了在Sf9細胞中的共表達，獲得了CYP6CW1重組酶。證明了CYP6CW1能代謝苯巴比妥，為鑑定該酶的天然底物奠定了基礎。從4齡Ⅰ型若蟲中腸組織分離了原代細胞，用不同抗性的水稻汁液處理第一代繼代細胞，檢測了凋亡的細胞，對AChE進行亞細胞定位和檢測其表達水平的變化。結果表明，感蟲水稻TN1、抗性水稻B5和TKM-6汁液處理細胞的凋亡率分別為8％、65%和85％。凋亡的細胞中都存在AChE的積累，且主要分布於細胞質；AChE在凋亡後期集中在細胞核附近。與對照細胞相比，TKM-6，B5和TN1處理的細胞中AChE的表達量分別升高了29.9, 18.4和8倍。用H2O2和花椒毒素分別處理細胞24小時後，檢測凋亡的細胞。結果表明：花椒毒素處理的細胞有少量的凋亡信號，而H2O2處理的細胞出現較多的凋亡信號。花椒毒素處理組細胞中AChE的表達量增加了1.44倍，而H2O2處理的細胞中AChE上調了3.36倍。取食AChE-miRNA的若蟲體內AChE表達水平下調了1.68倍，中腸細胞凋亡率下降為1.95%。凋亡過程中染色質濃縮並邊沿化，凋亡小體開始形成。這些研究結果不僅證實了水稻品種抗性水平與其誘導的細胞凋亡率呈正相關，而且揭示了氧化脅迫同樣誘導細胞凋亡，且凋亡的細胞質中都有AChE的積累。這些發現為揭示AChE在褐飛虱與水稻的互作中的功能、促進抗性水稻新品種的選育及開發新的褐飛虱防治措施提供了一定的參考信息。