《AAV介導的八因子抑制物免疫耐受誘導研究》是依託上海交通大學，由陸暉擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：AAV介導的八因子抑制物免疫耐受誘導研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：陸暉
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
血友病甲（HA）是最常見的遺傳性出凝血疾病，替代療法即給予患者外源性凝血因子VIII（hFVIII）是目前治療HA的唯一方法。然而反覆給予hFVIII易使患者產生抗hFVIII抗體即抑制物，可使hFVIII進入患者體內後迅速失活。誘導免疫耐受是唯一能根治hFVIII抑制物的治療方法，但這需要使患者長期暴露在相當劑量的hFVIII下，費用高療程長，難以在臨床實踐中推廣。本申請課題擬利用現代分子生物學技術克隆並篩選hFVIII蛋白內抗原表位多肽基因，利用腺相關病毒載體（AAV）在HA小鼠體內高表達備選抗原表位多肽，建立免疫耐受模型，探討Treg細胞在免疫耐受誘導中的作用，為AAV介導的誘導hFVIII抑制物免疫耐受的臨床套用提供可靠的實驗依據。
結題摘要
血友病甲（HA）是最常見的遺傳性出凝血疾病，誘導免疫耐受是唯一能根治凝血第八因子（FVIII）抑制物的治療方法，但這需要使患者長期暴露在相當劑量的FVIII下，費用高療程長，難以在臨床實踐中推廣。本研究的內容為通過AAV8病毒載體，在HA小鼠體內高表達FVIII或FVIII相關抗原，達到免疫耐受誘導的目的，即防止HA小鼠體內出現抑制物或者在已經發生抑制物的情況下，通過免疫耐受誘導降低抑制物的滴度。首先我們通過表面抗原決定簇的檢測發現，VWF與FVIII的結合後，掩蓋了眾多FVIII抗原決定簇，這可能是通過改變FVIII構象引起的。因此在進行免疫耐受誘導時，需採用FVIII相關抗原而非全長FVIII，以消除FVIII與VWF結合後對FVIII抗原決定簇的掩蓋的影響。在此基礎之上，我們分別克隆了FVIII輕鏈（LC）和重鏈（HC），由於HC分泌遠低於LC，我們在傳統的HC745基礎上設計了數個突變體，發現其中HCHL的細胞內表達量雖然與HC745類似，但其分泌量遠高於HC745，可以作為AAV8病毒載體介導的FVIII HC免疫耐受誘導的方案。本研究的重點在於考察AAV8介導的FVIII相關抗原基因表達誘導HA小鼠產生免疫耐受可行性，因而建立經FVIII誘導、能產生FVIII抑制物的HA小鼠模型至關重要。我們通過回交20代建立C57BL/6以及C3H/He遺傳背景的HA小鼠，並在這兩個品系HA小鼠基礎上成功建立了誘導FVIII抑制物產生的模型。利用LC的高表達，我們先以AAV8-LC以及空載AAV8載體分別免疫上述兩種品系的小鼠，8周后以較高劑量的重組FVIII靜脈注射挑戰來誘導抑制物產生。結果顯示，在兩種品系中均發現經AAV8-LC免疫的HA小鼠，其抑制物產生低於AAV8空載載體。調節性淋巴細胞CD4+CD25+T淋巴細胞比例在經AAV8-LC免疫的C3H/He HA小鼠中有顯著提高，而C57BL/6 HA小鼠中未發現類似現象。同時，ELISPOT檢測發現小鼠脾臟淋巴細胞INF-γ分泌頻數與FVIII抑制物的產生呈負相關，這個趨勢在C3H/HA小鼠中更明顯。這些結果提示，利用AAV8病毒載體在HA小鼠體內高表達FVIII相關抗原能起到免疫耐受誘導的作用，但在不同遺傳背景小鼠的免疫反應可能存在差異，這為揭示免疫耐受誘導的遺傳學機制提供了進一步研究的方向。
