《高通量鑑定T-DNA插入突變群體插入位點旁側序列》是趙素珍為項目負責人，中國科學院植物研究所為依託單位的面上項目。
基本介紹
- 中文名：高通量鑑定T-DNA插入突變群體插入位點旁側序列
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：趙素珍
- 依託單位：中國科學院植物研究所
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
建立能夠覆蓋全基因組序列的T-DNA插入突變群體並鑑定出插入突變位點是功能基因組學研究的重要手段之一。傳統的插入突變位點鑑定是一項非常龐大的工作。隨著高通量測序技術的迅猛發展，能夠利用高通量測序鑑定T-DNA插入位點將是一次重大的技術突破。高通量測序的關鍵是目標序列的富集及樣品前處理。為此，我們以短柄草插入突變群體為材料，率先開展如何將T-DNA插入突變位點的鑑定與高通量測序技術相結合的研究。通過構建突變株系DNA三維立體池，設計與高通量測序平台兼容的、長度不對稱的接頭序列及一系列特異引物，以池DNA為模板進行巢式PCR擴增，特異地富集T-DNA旁側序列進行高通量測序；對獲得的大量序列信息以短柄草基因組序列作為參考序列，進行分析、拼接、比對，確定插入突變位點，達到插入突變群體插入位點旁側序列鑑定與高通量測序平台整合的目的，實現高通量、高效率、低成本鑑定旁側序列。
結題摘要
建立能夠覆蓋全基因組序列的T-DNA插入突變群體並進行突變位點鑑定是功能基因組學研究的重要手段。短柄草作為新型的禾草類模式植物，構建其插入突變群體對基因組龐大的麥類作物研究具有十分重要意義。然而，傳統的插入突變位點鑑定方法工作量大，成本高，效率低。隨著高通量測序技術的發展，本項目起初擬利用高通量測序鑑定T-DNA插入位點，但在項目實施過程中發現高通量測序長度短，T-DNA在基因組整合複雜，大多數情況測不到基因組序列。為了達到高通量鑑定T-DNA插入位點的目的，我們以反向PCR為切入點，利用其擴增片段長，鑑定比例高的優點，對其效率低，成本高的缺點進行深入研究改進。在酶切位點、引物設計最優的前提下，首先從酶切反應體系及試劑用量方面進行最佳化，使傳統的20μl酶切反應體系縮小到2μl；隨後對連線反應體系及連線酶的用量進行了最佳化；最後對PCR反應進行最佳化。在一系列實驗過程中，通過選擇緩衝液，將多個反應壓縮在一個反應體系中完成，極大的便於自動化操作，一次可以鑑定96個株系，最終達到了高通量、低成本鑑定T-DNA插入位點的目的，而且操作簡便，數據分析相對簡單。與此同時，為了批量處理測序數據，快速準確找到插入位點，編寫了相應的序列分析軟體Perl腳本。在技術研究同時，一共分離了1300多個株系的旁側序列，其中794個株系擴增出目的片段並進行了測序和插入位點的詳細分析。該技術不僅用於短柄草T-DNA插入位點鑑定，也可以推廣套用到對其它植物插入突變位點的鑑定。
