高效氯氰菊酯降解酶PyDO的活性中心及降解機制研究

《高效氯氰菊酯降解酶PyDO的活性中心及降解機制研究》是依託華南農業大學，由胡美英擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：高效氯氰菊酯降解酶PyDO的活性中心及降解機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：胡美英
• 依託單位：華南農業大學

項目摘要

菊酯類農藥殘留污染已成為影響農產品和環境安全的重要因素。套用環境微生物或其工程菌，對受污染的農產品和環境進行原位生物修復或采後處理，是控制菊酯類農藥殘留危害的可行途徑。申請者在前期項目(30871660)時發現並深入研究了Ochrobactrum lupini DG-S-01對高效氯氰菊酯的降解作用，獲得了突變菌株M1及其降解酶PyDO，但其活性中心、降解機制等關鍵問題尚不清楚。本項目擬套用轉座子隨機突變技術，構建菌株M1的突變體文庫，利用轉座子的慶大黴素抗性基因和高效氯氰菊酯降解過程中產生水解圈與否篩選突變株，通過生物信息學、Tail-PCR、HPLC等手段確定降解功能基因；通過同源建模分析、活性位點突變，確定酶活性中心；通過活性中心點突變和高效氯氰菊酯分子碎片化處理，結合降解產物及活性驗證，揭示降解機制。研究結果將豐富農藥毒理學內容，為擬除蟲菊酯類農藥殘留污染治理提供關鍵技術支撐。

結題摘要

本項目在前期研究基礎上，篩選與鑑定了10餘株擬除蟲菊酯降解菌株；研究了氯氰菊酯對映異構體的反相液相分離條件和主要菌株對菊酯類農藥的降解特性，最佳化了其降解條件，開展了降解菌對蔬菜和土壤中殘留農藥的降解動力學研究；鑑定了代表性菌株的降解產物，分析確定了降解途徑；套用轉座子隨機突變等技術，構建了降解菌的基因組文庫和突變體文庫，利用轉座子的慶大黴素抗性基因和高效氯氰菊酯降解過程中產生水解圈與否篩選突變株，克隆獲得了系列的降解酶基因的克隆，研究了PyDO、estZ、ybfK、estA等基因的表達、純化及其酶學性質，通過生物信息學、Tail-PCR、HPLC等手段確證了相關酶的降解功能；建立了降解酶蛋白分子建模及活性中心模型，研究了高效氯氰菊酯降解分子機制和信號傳導機制。全面完成了項目計畫內容，研究結果豐富了農藥毒理學內容，為擬除蟲菊酯類農藥殘留污染微生物降解治理提供了技術支撐。