《體外重構細菌肽聚糖單體合成途徑的基礎研究》是依託華南理工大學，由馬毅擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：體外重構細菌肽聚糖單體合成途徑的基礎研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：馬毅
- 依託單位：華南理工大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
細菌細胞壁肽聚糖的生物合成途徑是抗生素研發的重要藥物靶標，採用傳統的篩選方法已經開發出四十多種抗菌藥物，但是在臨床套用後均出現了多重耐藥性菌株。本課題在前期單一功能性表達細菌肽聚糖單體合成途徑的8個組成酶的基礎上，通過自主構建和最佳化大腸桿菌無細胞表達體系，首次實現肽聚糖單體合成途徑的6個可溶性蛋白和2個膜蛋白在一個無細胞體系中同時功能性表達，深入研究膜蛋白MurG轉移酶與MraY轉位酶的細胞定位及相互作用。整合自動化檢測平台，從組合酶學角度構建一個抗耐藥性的抗菌分子篩選新模型。這一工作既能建立高通量篩選抗耐藥性抗生素的新方法，又能為深入研究肽聚糖合成機制奠定堅實的理論基礎和技術源頭。
結題摘要
隨著抗生素的濫用，細菌不斷進化獲得耐藥性，成為超級細菌。篩選針對細菌關鍵藥物靶點蛋白的新型抗菌物質必須跟上抗生素耐藥性發展。雖然針對細菌細胞壁肽聚糖生物合成途徑的胞質酶開發出多個抗菌化合物，但是以合成途徑的膜蛋白以及整條合成途徑為靶標開發抗菌物質依然比較困難。本課題通過構建和最佳化大腸桿菌無細胞表達體系，在體外重構細菌細胞壁肽聚糖單體合成途徑。系統地研究了常見致病菌百日咳桿菌、幽門螺桿菌、肺炎衣原體、伯氏疏螺旋體以及模式菌大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的細胞壁肽聚糖合成途徑的限速酶MraY轉位酶的酶學性質，發現來源於革蘭陰性菌的MraY轉位酶結構的正確摺疊需要一個相對穩定的磷脂納米盤形成的疏水環境，革蘭陽性菌MraY轉位酶在表面活性劑構成膠束中就具有較高的酶活。通過功能性地合成MraY轉位酶磷脂納米盤複合體和細胞基質蛋白MurA-MurF以及外周膜蛋白MurG，在體外成功重建完整的細菌細胞壁肽聚糖單體合成途徑，作為新型高效的抗菌藥物篩選平台。通過加入已知的抑制劑磷黴素、feglymycin與衣黴素等驗證了篩選平台的有效性。在上述工作的基礎上，採用無細胞蛋白表達系統合成MraY轉位酶抑制劑內在膜蛋白噬菌體174蛋白，成功地解決限制深入研究內在膜蛋白E的瓶頸問題。研究了催化細菌細胞壁肽聚糖合成途徑起始底物UDP-N-乙醯葡糖胺生物合成的藥物靶標醯基轉移酶GlmU的酶促反應動力學參數和反應條件，發現枯草芽孢桿菌GlmU酶具有較低的葡糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶活性。計算機模擬枯草芽孢桿菌GlmU蛋白質結構以及與底物分子結合，定點突變活性中心胺基酸進行驗證，為深入研究其酶促反應機制以及後續研發新型高效的抗菌藥物打下基礎。
