面向蛋白澱粉樣纖維化動態過程的質譜新方法開發

《面向蛋白澱粉樣纖維化動態過程的質譜新方法開發》是依託南京理工大學，由周敏擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：面向蛋白澱粉樣纖維化動態過程的質譜新方法開發
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：周敏
• 依託單位：南京理工大學

項目摘要

蛋白澱粉樣纖維化是超過50多種人類退行性疾病的元兇，其中著名的有阿茨海默症和Ⅱ型糖尿病。深入了解蛋白澱粉樣沉積的形成及抑制機制對於此類疾病的預防和治療至關重要。有證據表明神經退行性疾病中，澱粉樣蛋白細胞毒性最強的形式是纖維化過程中形成的寡聚中間體；然而，這些低聚蛋白在溶液中非常不穩定，通常以高度異質性形式存在，很難捕捉或大量獲取。為此，我們將在新近發展起來的離子淌度和非變性質譜技術的基礎上，建立蛋白去摺疊形成澱粉樣聚集的動態過程的質譜研究方法，探測從單個蛋白開始的構象變化，二聚體和低聚物的精確結構，它們是如何形成較大的團塊，以及與此相關的細胞毒性機理。這些研究將產生關於相關疾病的早期診斷和干預治療的非常有價值的信息。在此基礎上發展高通量的新的質譜檢測方法可用於快速評估潛在藥物分子與毒性寡聚蛋白的結合及其抑制模式。

結題摘要

蛋白質澱粉樣纖維化是涉及一系列結構不同中間狀態的複雜過程。其聚合過程的開始，也就是纖維化過程中的初始變性單體和小型寡聚重複單元是毒性最強的型態，然而由於這些低聚物在溶液中通常以高度異質性的形式存在，因而在溶液環境中非常不穩定，也就決定它們很難被大量獲取。為此我們成功建立了阿茲海默症相關的β-澱粉樣蛋白Aβ40 和Aβ42的穩定表達體系。通過對表達菌株的最佳化，我們採用rne131基因突變的大腸桿菌宿主進行表達，依靠提高目標mRNA穩定性，從而提高表達水平。為了研究膜蛋白和低聚多肽的潛在相互作用，我們構建了包含有一系列膜蛋白的大腸桿菌膜蛋白表達庫。通過對於表達策略，表達載體，編碼序列以及表達菌株的最佳化，我們成功實現了這些蛋白的表達純化以用於基於質譜的藥物治療靶點研究。針對在質譜分析中如何保持不穩定寡聚態蛋白中間體之間的非共價相互作用，我們開發了一種低能態下膠束輔助的非變性質譜方法，為澱粉樣蛋白高階寡聚中間體的離子淌度質譜研究鋪平了道路。利用這些手段，我們採用非變性質譜和離子淌度質譜相結合對澱粉樣蛋白Aβ肽的早期聚集展開探索，以Aβ40為對照，我們研究了表面活性劑模擬的膜環境中Aβ42寡聚態的形成並預測其三維結構模型。我們的數據支持Aβ42六聚體可作為神經退行性疾病研究中的一個潛在的治療靶點。