非典型的RNase III蛋白的結構及功能研究

《非典型的RNase III蛋白的結構及功能研究》是依託復旦大學，由甘建華擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：非典型的RNase III蛋白的結構及功能研究
• 依託單位：復旦大學
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：甘建華

項目摘要

RNA沉默是一種由雙鏈RNA誘導的、在真核生物中高度保守的基因沉默現象。作為一種有效的基因沉默手段，RNAi已經被廣泛地套用於功能基因組研究、藥物開發和基因治療等方面。小RNA分子（如siRNA和miRNA）與目的基因的特異性匹配是RNAi途徑的核心步驟。在大多數真核生物中，激發RNAi的siRNA和miRNA是由雙鏈RNA在RNase III 家族蛋白Dicer和Drosha的降解下形成的。然而，在一些生物體中卻存在一些非典型的RNase III家族蛋白；在結構域的組成上類似細菌RNase III，但形成的產物方面同Dicer更相似。本項目將綜合運用結構生物學和生物化學等多種手段對瘧疾變形蟲中的Eh-RNase III和擬南芥中的RNase III (AtRTL)蛋白進行研究，揭示其在植物和變形蟲中小RNA形成方面的作用，為RNAi在瘧疾變形蟲的控制方面提供結構方面的指導。

結題摘要

RNA沉默是一種由雙鏈RNA誘導的、在真核生物中高度保守的基因沉默現象。作為一種有效的基因沉默手段，基因沉默中的RNA干擾（RNA interference, RNAi）途徑已被廣泛地套用於功能基因研究、藥物開發和基因治療等方面。在大多數真核生物中，激發RNAi的小非編碼RNA（如siRNA和miRNA）是由雙鏈RNA在RNase III 家族蛋白的降解下形成的。在本項目的研究中，我們通過晶體學的方法解析了瘧疾變形蟲來源的Eh-RNase III蛋白及Eh-RNase III與Mn2+離子複合物的結構，發現Eh-RNase III缺少常規的dsRNA結合結構域，是一種非典型的RNase III家族蛋白。聯合體外底物結合和剪下實驗，我們發現Eh-RNase III通過多個分子之間的協同作用控制了產物的長度。這部分研究促進了我們對瘧疾變形蟲體內RNAi機制的了解。除了RNase III、Ago等幾個核心蛋白外，RNAi通路還受到其他多個調節蛋白的影響。在本項目的研究中，我們解析了首個C3PO與單鏈RNA複合物的晶體結構，揭示了C3PO識別和降解底物的分子機制。同閉合的C3PO-ssRNA複合物不同，C3PO單獨蛋白採取一種開放的構象，為RNA底物進出結構內部的活性催化區域提供了一個通道。通過定點突變以及體外活性研究，我們的結構同樣揭示了C3PO對底物切割位點選擇性的基礎。這部分研究對了解C3PO蛋白降解siRNA從屬鏈，促進RISC複合體的活化提供了幫助。同RNase III、Ago等蛋白類似，一些DNA分子同樣具有RNA降解能力，進而導致目的基因的沉默。8-17和10-23 DNAzyme能夠序列特異性地降解目的RNA,是發現最早、研究最廣泛的催化DNA分子，但是其催化機制並不明確。在本項目的研究中，我們解析了8-17 DNAzyme與底物類似物的複合物結構，發現8-17 DNAzyme採取一個獨特的V-shape構象。我們的結構是首個催化形式的RNA-cleaving DNAzyme結構，顯示8-17 DNAzyme套用酸鹼催化機制進行底物的降解。除了催化機理外，我們的結構同樣為8-17 DNAzyme的最佳化提供了結構基礎。