靜電自組裝納米三元複合體基因轉染機理的研究

項目摘要

磁轉染（Magnetofection）是備受關注的新型基因轉染技術。然而，關於轉染複合體的構建尚無理論指導；關於轉染複合體對轉染效率的影響規律及機理並不清楚。基於用靜電自組裝方法構建的三元複合體可成功轉染多種細胞的前期工作，我們提出納米磁粒-載體-基因三者之間的結合穩定性必須達到一定的平衡才能保證納米磁粒在細胞內外能可控運送並釋放基因。本項目擬選擇COS-7和NIH-3T3細胞為模型，在聚乙烯亞胺與納米磁粒用不同結合方法構建的轉染複合體的基礎上，通過研究不同複合體的穩定性對其細胞內吞途徑、在細胞內的命運及轉染效率的影響來證實我們的載體構建理論的正確性。本項目對於揭示轉染複合體的構建方法對基因轉染效率的影響規律及其機理具有重要的學術價值；對於指導合成、構建更高效的基因載體具有重要指導意義；對於進一步提高磁轉染的效率、推廣磁轉染技術具有具有重要套用價值。

結題摘要

本項目按計畫順利完成，發表SCI論文4篇，培養博士生1名。本課題主要包括三部分內容，1、研究了不同電性的納米磁粒構建的磁轉染三元複合體的轉染可行性，並且進一步用不同載體、不同細胞進行對照研究。2、研究了磁轉染的機理並提出了構建磁轉染載體的原則。3、研究了GSSG-MNPs的細胞內吞機理。 1、研究不同電性的納米磁粒構建的轉染複合體的轉染可行性本實驗在合成表面帶不同電荷的MNPs（MNPs-PEI，MNPs-CA，MNPs-CMD）的基礎上，進一步證實：（1）磁轉染三元複合體能夠通過靜電自組裝作用構建得到；（2）不僅帶正電的磁粒可以與載體及DNA組裝成轉染複合體，帶負電的磁粒也可以與載體及DNA組裝成轉染複合體；（3）自組裝轉染三元複合體能夠提高PEI或脂質體的基因表達水平和/或陽性細胞表達率；（4）轉染時間大大縮短，使實驗過程更為簡便。以上結果對於提高非病毒載體的轉染效率具有重要的指導意義。 2、轉染機理的證明設計三元複合體（載體PEI、共價修飾PEI的納米磁粒、pDNA），通過電泳實驗研究複合體的穩定性，通過TEM及共聚焦顯微鏡觀察研究三元複合體在細胞內的命運並提出假設，然後，通過轉染實驗證實了轉染複合體在細胞內的轉染機理。結果表明：（1）納米磁粒在轉染過程中沒有進入細胞核，它起的作用只是把轉染複合體拉到細胞表面；（2）pDNA/PEI複合體在進核之前必須先與MNPs-PEI分開，否則無法進核；（3）當磁轉染三元複合體中沒有自由PEI的時候，SPC-A1及COS-7細胞都沒有轉染成功。如果調節磁轉染三元複合體三組分的配比將會獲得不同的轉染結果。以上結果表明磁轉染三組分之間存在一個最優的組合。轉染複合體三個組分之間必須要達到一定的平衡，既要保持一定的緊密度使三者不易分開，以在磁場力作用下拉到細胞表面，又要使得PEI/pDNA能夠在細胞內脫離MNPs-PEI。此發現對於磁轉染複合體的構建具有指導意義，為進一步構建更高效的轉染複合體奠定了理論基礎。 3、研究了GSSG-MNPs的細胞內吞機理

靜電自組裝納米三元複合體基因轉染機理的研究

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