《靈芝三萜酸提取分離工藝方法》是安發（福建）生物科技有限公司於2015年4月1日申請的專利，該專利公布號為CN104761612A，公布日為2015年7月8日，發明人是高益槐、戴金玉、鄭春源、唐文波。
《靈芝三萜酸提取分離工藝方法》包括如下步驟：（1）先將靈芝發酵菌絲體或靈芝子實體粉碎後萃取，將萃取液合併，超聲處理；然後過濾分離；（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；將濾渣加入NaHCO3溶液，超聲處理，過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，分散得上清液；將上清液酸化得到酸化液；（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取後，收集併合並萃取液，將萃取液靜置，過濾，得到黃色清液；（4）將黃色清液減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，乾燥烘乾至恆重。該發明所得到的靈芝三萜酸純度高，且提取分離時間短，有效提取率高，有機溶劑的消耗較少，不造成二次污染，提取分離工藝操作簡便、成本經濟，能夠套用於大規模工業化生產。
2019年9月，《靈芝三萜酸提取分離工藝方法》獲得2019年度福建省專利獎三等獎。
基本介紹
- 中文名：靈芝三萜酸提取分離工藝方法
- 公布號：CN104761612A
- 公布日：2015年7月8日
- 申請號：2015101497891
- 申請日：2015年4月1日
- 申請人：安發（福建）生物科技有限公司
- 地址：福建省寧德市東僑經濟開發區國寶路36號
- 發明人：高益槐、戴金玉、鄭春源、唐文波
- 專利代理機構：福州市眾韜專利代理事務所
- 代理人：陳智雄、黃秀婷
- 分類號：C07J63/00(2006.01)I、C07H15/256(2006.01)I、C07H1/08(2006.01)I
- 本國優先權：2015100559655 2015.02.03 CN
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,榮譽表彰,
專利背景
靈芝三萜酸屬於靈芝的二級代謝物，是靈芝中除多糖外的另一種關鍵性藥效成分，具有止痛、鎮靜抑制組胺釋放、解毒、保肝、毒殺腫瘤細胞、提高機體免疫力、降血糖等作用。
2015年4月之前的技術中靈芝三萜酸的提取水平不高、產量偏低的現狀嚴重限制其工業化生產的發展，不能滿足現代工業化生產的需要。
截至2015年4月，已有的靈芝三萜酸提取方法通常有以下幾種：有機溶劑浸提法、大孔樹脂提取法以及超音波處理法。
有機溶劑浸提法通常需要較長的提取時間並消耗大量的提取溶劑，同時大量有機溶劑的使用會給人體和環境帶來不利的影響。另外，由於靈芝子實體由纖維素、半纖維素和木質素等主要成分構成，結構緊密，有機溶劑浸提法花費時間長、耗能高，不容易實現選擇型提取，活性成分提取得率低。
大孔樹脂提取法由於大孔吸附樹脂價格昂貴，吸附效果容易受流速和溶質濃度的影響，操作較為複雜，生產效率低下，造成生產成本極為高昂，同樣不適宜進行大規模工業化生產。
發明內容
專利目的
該發明的目的在於提供一種靈芝三萜酸提取分離工藝方法，該發明所提供的靈芝三萜酸提取分離工藝方法所得到的靈芝三萜酸純度高，且提取分離時間短，有效提取率高，有機溶劑的消耗較少，不造成二次污染，提取分離工藝操作簡便、成本經濟，能夠套用於大規模工業化生產。
技術方案
《靈芝三萜酸提取分離工藝方法》包括如下步驟：
（1）先將乾燥至恆重的靈芝發酵菌絲體或靈芝子實體粉碎後萃取三至四次，所述萃取方法為：先將靈芝發酵菌絲體或靈芝子實體的粉碎物與氯仿提取液按0.8-1.2:14（W:V）比例混合，接著將該混合液與濃度為4.8-5.2％（W:V）的NaHCO3溶液按照2.8-3.2:1（伏:伏）比例混合，浸泡22-26小時後，提取萃取液，將剩餘物質按照本方法進行下一次萃取；之後將幾次萃取獲得的萃取液合併，利用超聲輔助設備，在380-420瓦超聲輸出功率下，採用50-60千赫的超聲頻率，超聲處理28-32分鐘，停滯8-12分鐘，再次超聲處理28-32分鐘；然後過濾分離；
（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；先將濾渣按0.8-1.2:8（W:V）比例加入濃度為4.8-5.2％（W:V）的NaHCO3溶液，利用超聲輔助設備，在380-420瓦超聲輸出功率下，採用50-60千赫的超聲頻率，超聲處理28-32分鐘，停滯8-12分鐘，再次超聲處理28-32分鐘，之後利用孔徑為0.4-0.5微米的微孔濾膜過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，開啟分散機，調整轉速至4800-5200轉/分鐘，分散18-22分鐘，得上清液；之後在3.8-4.2℃冰浴條件下，將上清液用5.8-6.2摩爾/升的稀鹽酸進行酸化至pH＝2.8-3.2，得到酸化液；
（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取3-5次後，收集併合並萃取液，將萃取液靜置35-45分鐘，用孔徑0.4-0.5微米的微孔濾膜過濾，得到黃色清液；
（4）將黃色清液在44-46℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在58-62℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重；步驟（1）和步驟（3）所述的氯仿提取液是由氯仿和無水乙醇按照95:5-98:2的體積配比配置而成。
進一步的，步驟（3）中所述的萃取液在靜置前先加入纖維素複合酶進行酶解，酶解溫度45-55℃，pH5.5-6.5，酶解時間18-22分鐘，纖維素複合酶的加入量為萃取液的1.5-2.5％（W:V）；所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力4.8-5.2:2.8-3.2:1.8-2.2混合而成。
改善效果
《靈芝三萜酸提取分離工藝方法》比2015年4月之前的技術有如下優點：
1）採用該發明所得到的靈芝三萜酸純度高；
2）該發明的提取分離時間短；
3）該發明的有效提取率高；
4）該發明的有機溶劑的消耗較少，因此不僅使分離提取獲得的靈芝三萜酸純度高，而且不易造成二次污染；
5）該發明的提取分離工藝操作簡便、成本經濟；
6）該發明能夠套用於大規模工業化生產。
權利要求
1.《靈芝三萜酸提取分離工藝方法》包括如下步驟：
（1）先將乾燥至恆重的靈芝發酵菌絲體或靈芝子實體粉碎後萃取三至四次，所述萃取方法為：先將靈芝發酵菌絲體或靈芝子實體的粉碎物與氯仿提取液按0.8-1.2:14（W:V）比例混合，接著將該混合液與濃度為4.8-5.2％（W:V）的NaHCO3溶液按照2.8-3.2:1（伏:伏）比例混合，浸泡22-26小時後，提取萃取液，將剩餘物質按照本方法進行下一次萃取；之後將幾次萃取獲得的萃取液合併，利用超聲輔助設備，在380-420瓦超聲輸出功率下，採用50-60千赫的超聲頻率，超聲處理28-32分鐘，停滯8-12分鐘，再次超聲處理28-32分鐘；然後過濾分離；
（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；先將濾渣按0.8-1.2:8（W:V）比例加入濃度為4.8-5.2％（W:V）的NaHCO3溶液，利用超聲輔助設備，在380-420瓦超聲輸出功率下，採用50-60千赫的超聲頻率，超聲處理28-32分鐘，停滯8-12分鐘，再次超聲處理28-32分鐘，之後利用孔徑為0.4-0.5微米的微孔濾膜過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，開啟分散機，調整轉速至4800-5200轉/分鐘，分散18-22分鐘，得上清液；之後在3.8-4.2℃冰浴條件下，將上清液用5.8-6.2摩爾/升的稀鹽酸進行酸化至pH＝2.8-3.2，得到酸化液；
（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取3-5次後，收集併合並萃取液，將萃取液靜置35-45分鐘，用孔徑0.4-0.5微米的微孔濾膜過濾，得到黃色清液；
（4）將黃色清液在44-46℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在58-62℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重；
步驟（1）和步驟（3）所述的氯仿提取液是由氯仿和無水乙醇按照95:5-98:2的體積配比配置而成；
步驟（3）中所述的萃取液在靜置前先加入纖維素複合酶進行酶解，酶解溫度45-55℃，pH＝5.5-6.5，酶解時間18-22分鐘，纖維素複合酶的加入量為萃取液的1.5-2.5％（W:V）；所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力4.8-5.2:2.8-3.2:1.8-2.2混合而成。
2.根據權利要求1所述的靈芝三萜酸提取分離工藝方法，其特徵在於：步驟（3）所述的酸化液用等體積的氯仿提取液萃取3次後，收集併合並萃取液，在萃取液中加入纖維素複合酶，所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力5:3:2混合而成，靜置40分鐘，用孔徑0.45微米微孔濾膜過濾，得到黃色清液。
3.根據權利要求2所述的靈芝三萜酸提取分離工藝方法，其特徵在於：步驟（4）所述的黃色清液在45℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在60℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重。
實施方式
操作內容
《靈芝三萜酸提取分離工藝方法》包括如下步驟：
（1）先將乾燥至恆重的靈芝發酵菌絲體或靈芝子實體粉碎後萃取三至四次，所述萃取方法為：先將靈芝發酵菌絲體或靈芝子實體的粉碎物與氯仿提取液按0.8-1.2:14（W:V）比例混合，接著將該混合液與濃度為4.8-5.2％（W:V）的NaHCO3溶液按照2.8-3.2:1（伏:伏）比例混合，浸泡22-26小時後，提取萃取液，將剩餘物質按照本方法進行下一次萃取；之後將幾次萃取獲得的萃取液合併，利用超聲輔助設備，在380-420瓦超聲輸出功率下，採用50-60千赫的超聲頻率，超聲處理28-32分鐘，停滯8-12分鐘，再次超聲處理28-32分鐘；然後過濾分離；
（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；先將濾渣按0.8-1.2:8（W:V）比例加入濃度為4.8-5.2％（W:V）的NaHCO3溶液，利用超聲輔助設備，在380-420瓦超聲輸出功率下，採用50-60千赫的超聲頻率，超聲處理28-32分鐘，停滯8-12分鐘，再次超聲處理28-32分鐘，之後利用孔徑為0.4-0.5微米的微孔濾膜過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，開啟分散機，調整轉速至4800-5200轉/分鐘，分散18-22分鐘，得上清液；之後在3.8-4.2℃冰浴條件下，將上清液用5.8-6.2摩爾/升的稀鹽酸進行酸化至pH＝2.8-3.2，得到酸化液；
（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取3-5次後，收集併合並萃取液，然後加入纖維素複合酶進行酶解，酶解溫度45-55℃，pH＝5.5-6.5，酶解時間18-22分鐘，纖維素複合酶的加入量為萃取液的1.5-2.5％（W:V）；所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力4.8-5.2:2.8-3.2:1.8-2.2混合而成，將萃取液靜置35-45分鐘，用孔徑0.4-0.5微米的微孔濾膜過濾，得到黃色清液；
（4）將黃色清液在44-46℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在58-62℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重；步驟（1）和步驟（3）所述的氯仿提取液是由氯仿和無水乙醇按照95:5-98:2的體積配比配置而成。
所述靈芝發酵菌絲體優選通過以下方法獲得：
在培養基中添加400-500毫克/升的桔梗水提物或180-220毫克/升的金銀花和枸杞醇提物，之後接入靈芝菌絲體進行發酵培養，發酵培養條件如下：發酵起始pH值為5.5-6.5，溫度為28-32℃，搖床轉速為150-170轉/分鐘，發酵時間為166-170小時；發酵過程結束後將得到的靈芝發酵菌體烘乾至恆重；
所述培養基主要由以下組分配製而成（瓦/伏）：葡萄糖25.0-27.0克/升，玉米粉10.2-12.2克/升，麩皮粉9.8-11.8克/升和蛋白腖4.9-6.9克/升；
所述桔梗水提物的提取工藝如下：取桔梗90-110克，用水煎制煮沸25-35分鐘，倒出藥渣，補加適量冷水於藥渣中，再煮沸18-22分鐘，倒出藥汁，之後再補加適量冷水於藥渣中，煮沸18-22分鐘，倒出藥汁，合併藥汁，過濾藥汁，將過濾後的藥汁於55-65℃下乾燥，得到桔梗水提物。
所述金銀花和枸杞醇提物的提取工藝如下：將金銀花和枸杞按照0.8-1.2：1的質量配比混合後，30-50目粉碎，之後用紗布包好紮緊，放入酒精回流提取儀中，用2.5-3.5倍的乙醇提取2.5-3.5小時，獲得萃取液，將剩餘物質再加入2.5-3.5倍的乙醇提取1.5-2.5小時，再次獲得萃取液，之後合併兩次獲得的萃取液，旋蒸減壓濃縮得到金銀花和枸杞醇提稠狀物；所述乙醇的體積百分濃度為93-97％。
實施案例
一、靈芝發酵菌絲體實施例組
- 實施例組1（獲取靈芝發酵菌絲體）
實施例1-1
在培養基中添加450毫克/升的桔梗水提物，之後接入靈芝菌絲體進行發酵培養，發酵培養條件如下：發酵起始pH值為6，溫度為30℃，搖床轉速為160轉/分鐘，發酵時間為168小時；發酵過程結束後將得到的靈芝發酵菌體烘乾至恆重；
所述培養基主要由以下組分配製而成（瓦/伏）：葡萄糖26.0克/升，玉米粉11.2克/升，麩皮粉10.8克/升和蛋白腖5.9克/升；
所述桔梗水提物的提取工藝如下：取桔梗100克，用水煎制煮沸30分鐘，倒出藥渣，補加適量冷水於藥渣中，再煮沸20分鐘，倒出藥汁，之後再補加適量冷水於藥渣中，煮沸20分鐘，倒出藥汁，合併藥汁，過濾藥汁，將過濾後的藥汁於60℃下乾燥，得到桔梗水提物。
實施例1-2
實施例1-2與實施例1-1區別在於：將培養基中添加的桔梗水提物替換為200毫克/升的金銀花和枸杞醇提物。
所述金銀花和枸杞醇提物的提取工藝如下：將金銀花和枸杞按照1：1的質量配比混合後，40目粉碎，之後用紗布包好紮緊，放入酒精回流提取儀中，用3倍的乙醇提取3小時，獲得萃取液，將剩餘物質再加入3倍的乙醇提取2小時，再次獲得萃取液，之後合併兩次獲得的萃取液，旋蒸減壓濃縮得到金銀花和枸杞醇提稠狀物；所述乙醇的體積百分濃度為95％。
- 實施例組2（獲取靈芝發酵菌絲體）
實施例2-1
在培養基中添加400毫克/升的桔梗水提物，之後接入靈芝菌絲體進行發酵培養，發酵培養條件如下：發酵起始pH值為5.5，溫度為28℃，搖床轉速為150轉/分鐘，發酵時間為166小時；發酵過程結束後將得到的靈芝發酵菌體烘乾至恆重；
所述培養基主要由以下組分配製而成（瓦/伏）：葡萄糖25.0克/升，玉米粉10.2克/升，麩皮粉9.8克/升和蛋白腖4.9克/升；
所述桔梗水提物的提取工藝如下：取桔梗90克，用水煎制煮沸25分鐘，倒出藥渣，補加適量冷水於藥渣中，再煮沸18分鐘，倒出藥汁，之後再補加適量冷水於藥渣中，煮沸18分鐘，倒出藥汁，合併藥汁，過濾藥汁，將過濾後的藥汁於55℃下乾燥，得到桔梗水提物。
實施例2-2
實施例2-2與實施例2-1區別在於：將培養基中添加的桔梗水提物替換為180毫克/升的金銀花和枸杞醇提物。
所述金銀花和枸杞醇提物的提取工藝如下：將金銀花和枸杞按照0.8：1的質量配比混合後，30目粉碎，之後用紗布包好紮緊，放入酒精回流提取儀中，用2.5倍的乙醇提取3.5小時，獲得萃取液，將剩餘物質再加入2.5倍的乙醇提取2.5小時，再次獲得萃取液，之後合併兩次獲得的萃取液，旋蒸減壓濃縮得到金銀花和枸杞醇提稠狀物；所述乙醇的體積百分濃度為95％。
- 實施例組3（獲取靈芝發酵菌絲體）
實施例3-1
在培養基中添加500毫克/升的桔梗水提物，之後接入靈芝菌絲體進行發酵培養，發酵培養條件如下：發酵起始pH值為6.5，溫度為32℃，搖床轉速為170轉/分鐘，發酵時間為170小時；發酵過程結束後將得到的靈芝發酵菌體烘乾至恆重；
所述培養基主要由以下組分配製而成（瓦/伏）：葡萄糖27.0克/升，玉米粉12.2克/升，麩皮粉11.8克/升和蛋白腖6.9克/升；
所述桔梗水提物的提取工藝如下：取桔梗110克，用水煎制煮沸35分鐘，倒出藥渣，補加適量冷水於藥渣中，再煮沸22分鐘，倒出藥汁，之後再補加適量冷水於藥渣中，煮沸22分鐘，倒出藥汁，合併藥汁，過濾藥汁，將過濾後的藥汁於65℃下乾燥，得到桔梗水提物。
實施例3-2
實施例3-2與實施例3-1區別在於：將培養基中添加的桔梗水提物替換為220毫克/升的金銀花和枸杞醇提物。
所述金銀花和枸杞醇提物的提取工藝如下：將金銀花和枸杞按照1.2:1的質量配比混合後，50目粉碎，之後用紗布包好紮緊，放入酒精回流提取儀中，用3.5倍的乙醇提取2.5小時，獲得萃取液，將剩餘物質再加入3.5倍的乙醇提取1.5小時，再次獲得萃取液，之後合併兩次獲得的萃取液，旋蒸減壓濃縮得到金銀花和枸杞醇提稠狀物；所述乙醇的體積百分濃度為95％。
將實施例組1-3中任一實施例所得到的靈芝發酵菌絲體乾燥至恆重。
- 實施例組4
實施例4-1
（1）將實施例組1—實施例組3中任一實施例乾燥至恆重的靈芝發酵菌絲體粉碎後萃取三次，所述萃取方法為：先將靈芝發酵菌絲體的粉碎物與氯仿提取液按1:14（W:V）比例混合，接著將該混合液與濃度為5％（W:V）的NaHCO3溶液按照3:1（伏:伏）比例混合，浸泡24小時後，提取萃取液，將剩餘物質按照本方法進行下一次萃取；之後將幾次萃取獲得的萃取液合併，利用超聲輔助設備，在400瓦超聲輸出功率下，採用55千赫的超聲頻率，超聲處理30分鐘，停滯10分鐘，再次超聲處理30分鐘；然後過濾分離；
（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；先將濾渣按1:8（W:V）比例加入濃度為5％（W:V）的NaHCO3溶液，利用超聲輔助設備，在400瓦超聲輸出功率下，採用55千赫的超聲頻率，超聲處理30分鐘，停滯10分鐘，再次超聲處理30分鐘，之後利用孔徑為0.45微米的微孔濾膜過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，開啟分散機，調整轉速至5000轉/分鐘，分散20分鐘，得上清液；之後在4℃冰浴條件下，將上清液用6摩爾/升的稀鹽酸進行酸化至pH＝3，得到酸化液；
（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取4次後，收集併合並萃取液，之後靜置40分鐘，用孔徑0.45微米的微孔濾膜過濾，得到黃色清液；
（4）將黃色清液在45℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在60℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重；
步驟（1）和步驟（3）所述的氯仿提取液是由氯仿和無水乙醇按照18:1的體積配比配置而成。
實施例4-2
實施例4-2與實施例4-1區別在於：步驟（3）中所述的萃取液在靜置前先加入纖維素複合酶進行酶解，酶解溫度50℃，pH＝6，酶解時間20分鐘，纖維素複合酶的加入量為萃取液的2％（W:V）；所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力5:3:2混合而成。
- 實施例組5
實施例5-1
（1）將實施例組1—實施例組3中任一實施例乾燥至恆重的靈芝發酵菌絲體粉碎後萃取三次，所述萃取方法為：先將靈芝發酵菌絲體的粉碎物與氯仿提取液按0.8:14（W:V）比例混合，接著將該混合液與濃度為4.8％（W:V）的NaHCO3溶液按照2.8:1（伏:伏）比例混合，浸泡22小時後，提取萃取液，將剩餘物質按照本方法進行下一次萃取；之後將幾次萃取獲得的萃取液合併，利用超聲輔助設備，在380瓦超聲輸出功率下，採用50千赫的超聲頻率，超聲處理28分鐘，停滯8分鐘，再次超聲處理28分鐘；然後過濾分離；
（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；先將濾渣按1:10（W:V）比例加入濃度為4.8％（W:V）的NaHCO3溶液，利用超聲輔助設備，在380瓦超聲輸出功率下，採用50千赫的超聲頻率，超聲處理28分鐘，停滯8分鐘，再次超聲處理28分鐘，之後利用孔徑為0.4微米的微孔濾膜過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，開啟分散機，調整轉速至4800轉/分鐘，分散18分鐘，得上清液；之後在3.8℃冰浴條件下，將上清液用5.8摩爾/升的稀鹽酸進行酸化至pH＝2.8，得到酸化液；
（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取3次後，收集併合並萃取液，之後靜置35分鐘，用孔徑0.4微米的微孔濾膜過濾，得到黃色清液；
（4）將黃色清液在44℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在58℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重；
步驟（1）和步驟（3）所述的氯仿提取液是由氯仿和無水乙醇按照19:1的體積配比配置而成。
實施例5-2
實施例5-2與實施例5-1區別在於：步驟（3）中所述的萃取液在靜置前先加入纖維素複合酶進行酶解，酶解溫度45℃，pH＝5.5，酶解時間18分鐘，纖維素複合酶的加入量為萃取液的1.5％（W:V）；所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力4.8:2.8:1.8混合而成。
- 實施例組6
實施例6-1
（1）將實施例組1—實施例組3中任一實施例乾燥至恆重的靈芝發酵菌絲體粉碎後萃取三次，所述萃取方法為：先將靈芝發酵菌絲體的粉碎物與氯仿提取液按1.2:14（W:V）比例混合，接著將該混合液與濃度為5.2％（W:V）的NaHCO3溶液按照3.2:1（伏:伏）比例混合，浸泡26小時後，提取萃取液，將剩餘物質按照本方法進行下一次萃取；之後將幾次萃取獲得的萃取液合併，利用超聲輔助設備，在420瓦超聲輸出功率下，採用60千赫的超聲頻率，超聲處理32分鐘，停滯12分鐘，再次超聲處理32分鐘；然後過濾分離；
（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；先將濾渣按3:20（W:V）比例加入濃度為5.2％（W:V）的NaHCO3溶液，利用超聲輔助設備，在420瓦超聲輸出功率下，採用60千赫的超聲頻率，超聲處理32分鐘，停滯12分鐘，再次超聲處理32分鐘，之後利用孔徑為0.5微米的微孔濾膜過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，開啟分散機，調整轉速至5200轉/分鐘，分散22分鐘，得上清液；之後在4.2℃冰浴條件下，將上清液用6.2摩爾/升的稀鹽酸進行酸化至pH＝3.2，得到酸化液；
（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取5次後，收集併合並萃取液，之後靜置45分鐘，用孔徑0.5微米的微孔濾膜過濾，得到黃色清液；
（4）將黃色清液在46℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在62℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重；
步驟（1）和步驟（3）所述的氯仿提取液是由氯仿和無水乙醇按照49:1的體積配比配置而成。
實施例6-2
實施例6-2與實施例6-1區別在於：步驟（3）中所述的萃取液在靜置前先加入纖維素複合酶進行酶解，酶解溫度55℃，pH＝6.5，酶解時間22分鐘，纖維素複合酶的加入量為萃取液的2.5％（W:V）；所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力5.2:3.2:2.2混合而成。
二、靈芝子實體實施例組
- 實施例組7
實施例7-1
（1）將乾燥至恆重的靈芝子實體粉碎後萃取三次，所述萃取方法為：先將靈芝發酵菌絲體的粉碎物與氯仿提取液按1:14（W:V）比例混合，接著將該混合液與濃度為5％（W:V）的NaHCO3溶液按照3:1（伏:伏）比例混合，浸泡24小時後，提取萃取液，將剩餘物質按照本方法進行下一次萃取；之後將幾次萃取獲得的萃取液合併，利用超聲輔助設備，在400瓦超聲輸出功率下，採用55千赫的超聲頻率，超聲處理30分鐘，停滯10分鐘，再次超聲處理30分鐘；然後過濾分離；
（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；先將濾渣按1:8（W:V）比例加入濃度為5％（W:V）的NaHCO3溶液，利用超聲輔助設備，在400瓦超聲輸出功率下，採用55千赫的超聲頻率，超聲處理30分鐘，停滯10分鐘，再次超聲處理30分鐘，之後利用孔徑為0.45微米的微孔濾膜過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，開啟分散機，調整轉速至5000轉/分鐘，分散20分鐘，得上清液；之後在4℃冰浴條件下，將上清液用6摩爾/升的稀鹽酸進行酸化至pH＝3，得到酸化液；
（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取4次後，收集併合並萃取液，之後靜置40分鐘，用孔徑0.45微米的微孔濾膜過濾，得到黃色清液；
（4）將黃色清液在45℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在60℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重；
步驟（1）和步驟（3）所述的氯仿提取液是由氯仿和無水乙醇按照18:1的體積配比配置而成。
實施例7-2
實施例7-2與實施例7-1區別在於：步驟（3）中所述的萃取液在靜置前先加入纖維素複合酶進行酶解，酶解溫度50℃，pH＝6，酶解時間20分鐘，纖維素複合酶的加入量為萃取液的2％（W:V）；所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力5:3:2混合而成。
- 實施例組8
實施例8-1
（1）將乾燥至恆重的靈芝子實體粉碎後萃取三次，所述萃取方法為：先將靈芝發酵菌絲體的粉碎物與氯仿提取液按0.8:14（W:V）比例混合，接著將該混合液與濃度為4.8％（W:V）的NaHCO3溶液按照2.8:1（伏:伏）比例混合，浸泡22小時後，提取萃取液，將剩餘物質按照本方法進行下一次萃取；之後將幾次萃取獲得的萃取液合併，利用超聲輔助設備，在380瓦超聲輸出功率下，採用50千赫的超聲頻率，超聲處理28分鐘，停滯8分鐘，再次超聲處理28分鐘；然後過濾分離；
（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；先將濾渣按1:10（W:V）比例加入濃度為4.8％（W:V）的NaHCO3溶液，利用超聲輔助設備，在380瓦超聲輸出功率下，採用50千赫的超聲頻率，超聲處理28分鐘，停滯8分鐘，再次超聲處理28分鐘，之後利用孔徑為0.4微米的微孔濾膜過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，開啟分散機，調整轉速至4800轉/分鐘，分散18分鐘，得上清液；之後在3.8℃冰浴條件下，將上清液用5.8摩爾/升的稀鹽酸進行酸化至pH＝2.8，得到酸化液；
（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取3次後，收集併合並萃取液，之後靜置35分鐘，用孔徑0.4微米的微孔濾膜過濾，得到黃色清液；
（4）將黃色清液在44℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在58℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重；
步驟（1）和步驟（3）所述的氯仿提取液是由氯仿和無水乙醇按照19:1的體積配比配置而成。
實施例8-2
實施例8-2與實施例8-1區別在於：步驟（3）中所述的萃取液在靜置前先加入纖維素複合酶進行酶解，酶解溫度45℃，pH＝5.5，酶解時間18分鐘，纖維素複合酶的加入量為萃取液的1.5％（W:V）；所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力4.8:2.8:1.8混合而成。
- 實施例組9
實施例9-1
（1）將乾燥至恆重的靈芝子實體粉碎後萃取三次，所述萃取方法為：先將靈芝發酵菌絲體的粉碎物與氯仿提取液按1.2:14（W:V）比例混合，接著將該混合液與濃度為5.2％（W:V）的NaHCO3溶液按照3.2:1（伏:伏）比例混合，浸泡26小時後，提取萃取液，將剩餘物質按照本方法進行下一次萃取；之後將幾次萃取獲得的萃取液合併，利用超聲輔助設備，在420瓦超聲輸出功率下，採用60千赫的超聲頻率，超聲處理32分鐘，停滯12分鐘，再次超聲處理32分鐘；然後過濾分離；
（2）過濾分離後得到濾液α和濾渣；先將濾渣按3:20（W:V）比例加入濃度為5.2％（W:V）的NaHCO3溶液，利用超聲輔助設備，在420瓦超聲輸出功率下，採用60千赫的超聲頻率，超聲處理32分鐘，停滯12分鐘，再次超聲處理32分鐘，之後利用孔徑為0.5微米的微孔濾膜過濾得到濾液β；接著將濾液α和濾液β合併，開啟分散機，調整轉速至5200轉/分鐘，分散22分鐘，得上清液；之後在4.2℃冰浴條件下，將上清液用6.2摩爾/升的稀鹽酸進行酸化至pH＝3.2，得到酸化液；
（3）將酸化液用等體積的氯仿提取液萃取5次後，收集併合並萃取液，之後靜置45分鐘，用孔徑0.5微米的微孔濾膜過濾，得到黃色清液；
（4）將黃色清液在46℃條件下減壓蒸乾得到黃色粘稠液體，將黃色粘稠液體在62℃水浴條件下乾燥烘乾至恆重；
步驟（1）和步驟（3）所述的氯仿提取液是由氯仿和無水乙醇按照49:1的體積配比配置而成。
實施例9-2
實施例9-2與實施例9-1區別在於：步驟（3）中所述的萃取液在靜置前先加入纖維素複合酶進行酶解，酶解溫度55℃，pH＝6.5，酶解時間22分鐘，纖維素複合酶的加入量為萃取液的2.5％（W:V）；所述纖維素複合酶由纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按比活力5.2:3.2:2.2混合而成。
三、實驗數據
經過對各實施例的測試，該靈芝三萜酸提取分離工藝方法各項技術指標如下各表所示：
表1為該發明所提供的靈芝三萜酸提取分離工藝方法的實施例組1-實施例組3中所獲取的靈芝發酵菌絲體的實驗數據：
項目 | 單位 | 實施例1-1 | 實施例1-2 | 實施例2-1 | 實施例2-2 | 實施例3-1 | 實施例3-1 | 常規工藝 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
生物量（DC瓦） | 克/升 | 9.7 | 9.6 | 9.3 | 9.2 | 9.1 | 9.0 | 7.6 |
生物量提高率 | - | 27.7% | 2６.3% | 22.4% | 21.1% | 19.8% | 18.4% | - |
胞內三萜酸 | 毫克/升 | 249 | 243 | 237 | 232 | 221 | 221 | 192.5 |
胞內三萜酸提高率 | - | 29.3% | 26.2% | 23.1% | 20.5% | 14.8% | 14.3% | - |
胞外三萜酸 | 毫克/升 | 310 | 302 | 340 | 330 | 366 | 230 | 230 |
胞外三萜酸提高率 | - | 34.7% | 31.3% | 47.8% | 43.5 | 59.1% | 56.5% | - |
從表1可明顯看出，該發明所提供的靈芝三萜酸提取分離工藝方法過程中所獲取的靈芝發酵菌絲體的生物量較常規工藝能提高18.4％-27.7％，最終所獲取的胞外三萜酸較常規工藝均有大幅提高，其中胞內三萜酸提高率為14.3％-29.3％，胞外三萜酸提高率為34.7％-59.1％,其中,培養基中添加桔梗水提物對比添加金銀花和枸杞醇提物區別不明顯。
表2為該發明所提供的靈芝三萜酸提取分離工藝方法的各實施例有機溶劑的回收比例及消耗比例的實驗數據：
項目 | 有機溶劑回收比例 | 有機溶劑消耗比例 |
|---|---|---|
實施例4-1 | 98.67％ | 1.33％ |
實施例5-1 | 98.57％ | 1.43％ |
實施例6-1 | 99.24％ | 0.76％ |
實施例7-1 | 97.45％ | 2.55％ |
實施例8-1 | 98.56％ | 1.44％ |
實施例9-1 | 98.34％ | 1.66％ |
實施例4-2 | 98.46％ | 1.54％ |
實施例5-2 | 98.77％ | 1.23％ |
實施例6-2 | 99.39％ | 0.61％ |
實施例7-2 | 97.31％ | 2.69％ |
實施例8-2 | 97.69％ | 2.31％ |
實施例9-2 | 96.92％ | 3.08％ |
從表2可明顯看出，該發明所提供的靈芝三萜酸提取分離工藝方法的各實施例有如下優點：（1）有機溶劑消耗較少，不容易對提取分離得到的靈芝三萜酸造成二次污染；（2）回收比例高，在一定程度上節省成本。
表3為該發明所提供的靈芝總三萜酸提取分離工藝的各實施有效提取率和提取純度的實驗數據：
項目 | 有效提取率 | 總三萜純度 |
|---|---|---|
實施例4-1 | 4.58％ | 94.7％ |
實施例5-1 | 4.72％ | 95.3％ |
實施例6-1 | 5.11％ | 96.9％ |
實施例7-1 | 4.22％ | 95.3％ |
實施例8-1 | 5.52％ | 96.6％ |
實施例9-1 | 5.63％ | 94.2％ |
實施例4-2 | 5.38％ | 93.6％ |
實施例5-2 | 5.32％ | 94.3％ |
實施例6-2 | 6.11％ | 95.9％ |
實施例7-2 | 5.02％ | 94.3％ |
實施例8-2 | 6.12％ | 95.6％ |
實施例9-2 | 6.23％ | 94.8％ |
從表3可明顯看出，該發明所提供的靈芝三萜酸提取分離工藝方法的各實施例均具有較高的有效提取率，提取分離所得的靈芝三萜酸純度高；特別是加入複合纖維酶的實施例4-2至實施例9-2對比沒加複合纖維酶的實施例4-1至實施例9-1增加20％左右的總三萜酸有效提取率。
榮譽表彰
2019年9月，《靈芝三萜酸提取分離工藝方法》獲得2019年度福建省專利獎三等獎。
