《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》是南京林業大學於2002年4月29日申請的專利，該專利的申請號為021129487，公布號為CN1375191，公布日為2002年10月23日，發明人是施季森、陳金慧、諸葛強、黃敏仁，該發明屬林業行業中的細胞工程種苗繁育技術領域。
《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》特徵是在鵝掌楸屬雜交親本選擇和種間雜交育種的基礎上，分別將正交、反交和回交制種所得數量有限的未成熟胚進行體細胞胚胎髮生的誘導和培養，形成大量同步發育的體細胞胚，進而將體細胞胚培育成為完整的植株。利用該發明所提供的方法，可實現雜交鵝掌楸苗木的大規模、短周期、高繁殖率、低成本的工廠化生產和產業化開發。
2011年，《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》獲得第七屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
（概述圖為《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術
- 公布號：CN1375191
- 公布日：2002年10月23日
- 申請號：021129487
- 申請日：2002年4月29日
- 申請人：南京林業大學
- 地址：江蘇省南京市龍蟠路新莊9號
- 發明人：施季森、陳金慧、諸葛強、黃敏仁
- 分類號：A01H4/00
- 代理機構：南京經緯專利代理有限責任公司
- 類別：發明專利
- 代理人：唐建清
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
鵝掌楸，又稱馬褂木、鴨腳木、九層皮、楓荷樹等，是木蘭科（Magnoliaceae）鵝掌楸屬（Liriondendron）的植物。該屬現在僅存兩種，一種是分布於我國中、北亞熱帶地區（從東部的浙江、福建延伸到西南部的雲南、中越邊界）的中國鵝掌楸（L.chinense[Hemsl.]Sarg.），另一種是分布於美國東部的北美鵝掌楸（L.tulipiferaL.）。鵝掌楸屬植物在被子植物分類地位中處於較原始的位置。雖然分布區廣，但2002年4月前多呈小群體分布。其中分布於中國境內的鵝掌楸已被列為國家二級珍稀瀕危保護樹種。
中國鵝掌楸乾形通直、樹形美觀；葉形奇特，葉片寬大，微凹，兩側有一裂片，先端截形，葉形儼然如中國古裝馬褂一般，故俗稱馬褂木；春天枝條頂端開淡黃色大型花朵，其狀如杯似碗，光燦悅目，觀賞價值高；果實圓錐形，亦極美觀。該樹種對二氧化硫和氯氣有較強的抗性，廣泛用於園林綠化。另外，鵝掌楸屬植物木材淡紅褐色，紋理通直，色澤美觀，結構細密，材質輕軟，刨面光潔，適合於用作膠合板、紙漿、家具以及室內裝飾用材，以及用於建築、造船等，經濟價值極高，因此也是重要的用材樹種。
作為世界珍稀名貴觀賞風景樹的北美鵝掌楸，同樣樹姿挺秀，葉形美麗，樹形端正，樹序整齊，花大而美。老齡樹枝條平展，或微向下垂。每屆花期，瓊英壓樹，翠帷覆地，綺麗優雅。
葉培忠教授於1963年首次選用中國鵝掌楸和北美鵝掌楸為親本進行正、反交組合人工雜交，育成種間雜種雜交鵝掌楸（L.chinense[Hemsl.]Sarg.×L.tulipiferaL.和L.tulipiferaL.×L.chinense[Hemsl.]Sarg）；1970年開始進行雜交鵝掌楸正、反交組合苗木栽培對比。試驗表明，種間雜交後代具有明顯的雜交優勢，不僅樹形比親本更加通直，花葉更加幽麗，媲美眾芳，俯視眾卉，而且生長也更加迅速。如栽植於浙江富陽中國林科院亞林所的雜交鵝掌楸，12年生時樹高達14米，胸徑達37厘米；另據北京市園林局將雜交鵝掌楸作城市行道樹試種，在北京地區表現出耐寒性強，生長迅速的特點；同時該樹種無其他樹種果毛、花絮飛散造成的空氣污染之弊。因此，林業上對優質雜交鵝掌楸苗木的需求相當迫切。
但鵝掌楸的天然結實率很低，親本和雜交新種均僅有1％左右，有性繁殖能力差；鵝掌楸的扦插技術要求很高，成活率低，無性繁殖困難。因此，2002年4月前的種苗繁殖技術無法滿足大面積植樹造林的需要。
體細胞胚胎髮生及其植株再生技術是20世紀90年代形成的高新林業生物技術的重要內容之一，可用於優良品種的大規模繁殖和用於遺傳轉化體系的建立。體細胞胚，是指二倍體或單倍體細胞在未經性細胞融合的過程，模擬合子胚發生的各個階段而發育形成一個新的個體的形態發生和重建過程。在正常情況下有些植物的珠心組織或助細胞也可自發產生體細胞胚。在大量的組織培養過程中，許多離體培養的細胞、組織和器官，形成類似胚的結構。這種經體細胞胚發生而形成的在形態結構和功能上類似於有性胚的結構被稱之為體細胞胚或胚狀體。無性胚狀體可以像有性胚那樣在一定的條件下發育成完整的植株。胚狀體按其來源可分為兩類：一類是由普通植物孢子體的各種器官的二倍體體細胞產生而來，通常稱為體細胞胚；另一類是由小孢子或其分裂產物等單倍體細胞產生的胚狀體，通常簡稱為花粉胚，可發育成單倍體植株，但一般必須進行染色體加倍才能正常開花結實。另外，在一些植物中也可從胚乳培養得到胚狀體，但未能成功地由胚狀體發育成植株。朱微認為胚狀體的定義包括三點含義：（1）胚狀體是組織培養的產物，只限於在組織培養範圍內使用，區別於無融合生殖的胚；（2）胚狀體起源於非合子細胞，區別於合子胚；（3）胚狀體的形成經歷胚胎髮育的過程，區別於與組織培養中分化的芽體。
1902年Haberlandt提出植物細胞的全能性觀點，即每一個細胞都能不斷分裂，進而形成完整的植株。Steward（1958）和Reinert（1959）差不多同時發現，培養的胡蘿蔔根細胞產生一種與胚相似的結構，並觀察到由這種結構長成完整的植株。從而證明Haberlandt關於細胞全能性概念的正確性。此後，植物學家對此進行了廣泛的研究，並已在許多植物中利用不同的器官、組織、細胞和原生質體進行培養得到了體細胞胚。成功獲得體細胞胚的有裸子植物、雙子葉植物和單子葉植物。林木體細胞胚胎髮生研究始於20世紀七十年代後期，八十年代後期得到迅速發展，並獲得極大成功。全世界2002年4月前已有40多種木本植物獲得了體細胞胚，尤其是用常規無性繁殖技術很難生根的針葉樹的體胚發生取得了令人矚目的進展。據初步統計，已從冷杉屬、落葉松屬、雲杉屬、松屬、黃杉屬和北美紅杉屬的至少20種不同的針葉樹的外植體誘導成功了體細胞胚。在闊葉樹種上，柳屬、楊屬、栗屬、檀香屬、楓香屬、鵝掌楸屬、榛屬、櫟屬、板栗屬、山茶屬、桉樹屬、七葉樹屬、柑橘屬、柚木、可可、油橄欖、橡膠、泡桐等20多個樹種的組織培養中觀察到體細胞胚胎髮生或獲得再生植株。其中，美國的惠豪公司、國際紙業公司、維斯瓦庫公司和加拿大的一些公司、紐西蘭林業研究中心等已分別將火炬松、挪威雲杉、花旗松和輻射松等樹種的體細胞胚誘導和植株再生套用於生產實踐。僅紐西蘭一家公司就形成了年產200萬株輻射松體細胞胚再生植株的能力。中國科學院於1988年以華北雲杉為實驗材料，將幼胚產生的愈傷組織誘導出的體細胞胚胎髮育成小苗。黑龍江農大（1993）進行黑穗醋栗末受精胚珠培養，成功誘導體細胞胚胎和植株。四川農大王米力等（1996）用尾葉桉種子下胚軸誘導體細胞胚胎髮生，獲得根苗齊全的再生植株。在幾十年的研究工作中，研究人員積累了大量的可貴資料，主要如下：
1.植物體的各種器官，如根、莖、葉、花、果實、種子、子房中的胚珠、雄蕊的花絲、花葯及花粉都可以產生體細胞胚胎。但S.Merkle（1996）認為，樹木的胚性培養只能來源於種子或幼苗，合子胚或種子的發育程度是很重要的，在許多樹種的研究中表明，未成熟種子比成熟種子或幼苗有更高的誘導潛能。
2.外植體在接種前必須在低溫條件下（4～8℃）冷藏一段時間，如裸子植物要冷藏1～2個月，沒有低溫處理不能啟動。但低溫冷藏時間過長，體胚發生能力會下降。
3.誘導體細胞胚胎，第一階段需要高濃度的生長素，如2,4-D、NAA，此時外植體脫分化形成愈傷組織，即而誘導形成胚性細胞；第二階段體細胞胚胎的形成和發育，必須降低生長素的濃度或完全除去生長素。
4.培養基中氮源的含量及形式是誘導體細胞胚胎的一個重要條件。還原態氮（NH4）對體細胞胚胎的誘導有利，而且高氮含量的MS培養基已經誘導出多種植物的體細胞胚胎。Reinert（1972）認為，體細胞胚胎的形成不是與培養基中氮的絕對量有關，而是與氮和生長素的比例有關。
5.一些天然複合物如水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）、大豆蛋白腖、麥芽汁、酵母提取物和椰子汁，它們既可以提供有機氮源、又對細胞分裂素和肌醇起作用，從而促進體細胞胚的形成。但在體細胞胚胎形成以後，要除去這些物質，否則會抑制體胚的發芽。
6.懸浮培養系的建立。在液體懸浮培養中，愈傷組織可以和培養基充分接觸，營養物質在培養基的每個區域的濃度較均一，利於懸浮組織的同步生長。另外，懸浮培養大大改善了培養物的生存環境，這裡氣體交換順暢，光照條件優越。
7.滲透壓可以影響胚性細胞的生長發育，利用蔗糖、甘露醇、山梨醇和聚乙二醇（PEG）提高細胞的滲透壓，創造一個乾旱的環境，可以抑制早期萌發，明顯提高胚成熟的機率而獲得同步成熟好、質量高的體細胞胚胎，貯藏物的水平也會顯著增加。
8.在生理濃度ABA（10和10摩爾/升）的作用下，胚發育不正常的情況如子葉合生、早熟發芽等會受到抑制。
9.光照和溫度條件。組織培養中，除了某些材料需要在黑暗中生長外，一般均需要光照。S.Merkle認為，美國楓香的胚狀體在黑暗與光照條件下均能發育，但是黑暗條件下發育得更健康。光源以螢光燈、白熾燈為多。不同波長的光源，對培養器官的增殖和器官分化有明顯影響。如紅豆杉的組培中，多採用紅光。一般情況下，培養在25±2℃的恆溫條件下進行。
在大量的研究中發現，在體細胞胚胎形成的所有條件中，培養基中的激素種類及濃度，培養基的多種營養成分均起著重要作用。而一些物理因素，如光照和溫度等也有明顯的影響。同時，也注意到組織的來源及其生理狀態，對後期培養時的生長情況及分化有很大的影響。在培養基的各種成分之中，植物激素對於體胚形成，起著明顯而重要的調節作用。其中影響最顯著的是生長素和細胞分裂素。有時也是用赤黴素、脫落酸、乙烯以及其他人工合成的生長調節物質。使用激素要注意激素的種類和濃度，因為各種生長物質的穩定性、效應及其對體胚形成的影響有明顯的差別。同時，不同激素處理的順序也有明顯的影響。在組織培養中用於調節胚狀體形成的生長素和細胞分裂素，常用的種類如下：生長素類：吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2,4-D，吲哚丁酸（IBA）；細胞分裂素類：激動素（KT）、6-苄胺基嘌呤（BA）、異戊基腺嘌呤（2iP）、玉米素（ZT）。
為了誘導胚性愈傷組織或懸浮培養細胞形成胚狀體，連續改變培養基特別是激素成分十分重要。2,4-D在胚性愈傷組織的誘導中起著重要作用，多種植物組織培養誘導脫分化都必須有2,4-D存在，而誘導脫分化後必須降低或去掉2,4-D，胚性細胞才能正常發育。Halperin（1970）取胡羅卜的葉柄切段，培養於加有不同激素成分的瓊脂培養基上，然後移至不加任何激素的基本培養基上（僅有無機鹽、蔗糖及維生素B1），以檢查對胚狀體形成的影響。結果表明：④促進胚性愈傷組織增殖的培養及其激素成分並不促進胚狀體的分化；去除培養基中的2,4-D，則使胚狀體形成；加入BA，組織增殖速度增加，但抑制了轉移培養基上後胚狀體的形成，並且一旦胚狀體原始細胞形成後，BA對其發育成胚狀體毫無影響。②加入赤黴素，完全抑制其後胚狀體的分化。③細胞增殖過程中的激素環境對下一步器官分化有著明顯的影響。
有實驗結果表明，2,4-D通過改變細胞內源IAA代謝而起作用，在水稻的早期胚性愈傷組織中，用ELISA酶聯免疫分析證明胚性細胞出現時伴有較高的內源IAA水平，並且在胚性細胞轉換時期添加外源IAA對胚性細胞出現有一定誘導效果。
ABA是體細胞胚發生中另外一種重要的激素，早在1974年，Ammirato報導了ABA可促進葛縷子體細胞胚胎髮育。水稻愈傷組織浸ABA處理後，游離胺基酸含量明顯提高，蛋白質含量與胚性對照相近，SDS-PAGE表明，出現胚性多肽譜帶。用ELISA酶聯免疫方法測定了黨參胚性細胞形成球形胚的過程中，內源ABA的含量變化，結果表明，在這一過程中內源ABA含量持續增加。Kamada等在胡蘿蔔細胞培養中，發現內源ABA含量一直保持比較低的水平，但從非胚性細胞轉化為胚性細胞，由胚性細胞團發育形成有形態結構的球形胚，在這兩個體細胞胚發生的質變階段中，均伴隨著內源ABA的增加。在香菜體胚發生研究中，Ammirato（1973）發現在ABA的影響下，通常出現的不正常胚發育（如在下胚軸上形成不定胚，子葉合生，苗提前發育等）受到抑制；與不加ABA時所產生的胚狀體相比更接近於合子胚的發育情況。
至於培養基的無機及有機營養物質的影響，相對來說沒有激素的作用那么明顯。同時，在培養基中通常已經包含植物生長所必需的無機元素和營養物質，不同的培養基配方儘管千差萬別，但基本上都含有這些物質。雖然如此，在胡羅卜的細胞培養中已經發現培養基中的氮素含量與胚狀體的形成有密切關係。組織培養中常用的兩種培養基White培養基和MS培養基，其含氮量有很大的差異，前者在3.2毫摩爾/升，後者在60毫摩爾/升。通常認為White培養基不適於胚狀體的分化。事實上，當把White培養基的含氮量用硝酸鉀（KNO3）提高到40～60毫摩爾/升時，即可使之全部形成胚狀體。Ammirato（1969）用NH4NO3提高White培養基的含氮量，也可達到MS培養基的效果。Reinert（1967）證實了NH4對於誘導胡羅卜培養中胚狀體的形成，比其他氮源更為有效。Halperin（1971）亦發現不同氮源中對於胚狀體的形成，NH4和水解酪蛋白的促進作用明顯優於NO3或谷氨醯胺。
在所有的有機化合物中間，常用的有維生素、胺基酸、核酸鹼基（嘌呤、嘧啶類化合物）、糖類等。維生素中常用的是硫胺素、肌醇、煙酸、吡哆素等，其中硫胺素的作用最為明顯，而在組織培養中加入肌醇也一直認為是有好處的。為了促進胚狀體的形成，在很多情況下也常用一些天然複合物，如水解酪蛋白或水解乳蛋白、大豆蛋白腖、麥芽汁、酵母提取物和椰子汁等，其中椰子汁使用特別多。現經大量的研究，已知其影響生長和分化的有效成分是細胞激動素類物質和肌醇等。
滲透劑在林木體胚發生的各個階段都發揮著重要作用。總的說來，滲透劑都是高度水合性的多羥基分子，包括單糖、多糖、己糖醇和環多醇。環多醇是六碳環的羥基複合物，較常用的環多醇有肌醇及其立體異構體鯊肌醇等。蔗糖和葡萄糖是常用的兩種糖類滲透劑，山梨醇、D-甘露醇和半乳糖醇的直鏈醇形式、及乙二醇如聚乙二醇和聚丙二醇也可用作滲透劑。唐巍（1998）在火炬松的胚性愈傷組織誘導和植株再生的研究中，加入9000毫克/升肌醇提高滲透壓，以促進後期胚的發育。黃健秋（1995）將馬尾松的早期原胚轉至含9000毫克/升肌醇的DCR培養基上，形成後期原胚。可見，體胚形成過程中適當提高滲透壓可促進體胚形成。
在植物組織培養中，誘導體細胞胚胎髮生和誘導器官發生相比具有顯著的特點：①具有兩極性：在體細胞胚發生早期就具有胚根和胚芽兩極，胚性細胞分裂多為不均等分裂，形成頂細胞和基細胞，其後有較小的頂細胞繼續分裂形成多細胞原胚，而較大的基細胞進行少數幾次分裂成為胚柄部分，在形態上具有明顯的極性。②存在生理隔離：體細胞胚形成後與母體植物或外植體的維管束系統聯繫較少，即出現所謂生理上的隔離現象。胚性細胞細胞壁加厚，與其它細胞分開，周圍細胞處於解體狀態，表明體細胞胚與合子胚相似，從一開始就是完整的植物體的雛形。③遺傳相對穩定：通過體細胞胚形成的再生植株的變異性小於器官發生途徑形成的再生植株，因為只有那些未經過畸變的細胞或變異較少的細胞團才能形成體細胞胚，實現全能型表達。④重演受精卵形態發生的特徵：植物組織培養中形態發生的幾種方式，雖然都是植物細胞全能性的具體表現，但體細胞胚胎髮生途徑是細胞全能型表達最完全的一種方式，它不僅表明植物體細胞具有全套遺傳信息，而且重演了合子胚形態發生的進程。
植物組織培養中誘導體細胞胚發生途徑可歸納為兩種：直接途徑與間接途徑。直接途徑就是從外植體某些部位直接誘導分化出體細胞胚，如槐樹子葉在切口處產生愈傷組織的同時，在子葉組織中分化產生體細胞胚。槐樹子葉離體培養既可以直接途徑形成體細胞胚，也可以通過脫分化形成愈傷組織後，再從愈傷組織的某些細胞分化出體細胞胚，即稱為間接途徑。大多數植物的體細胞胚胎髮生多通過間接途徑進行，在愈傷組織中某些體細胞轉化為胚性細胞、胚性細胞繼續分裂形成多細胞原胚以及不同發育時期的體細胞胚，如經過球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚而發育成小苗。
體細胞胚胎髮生由於能在更短的時間內得到更多的營養繁殖體，以及獲得更大的遺傳增益，並且由於體胚發生培養物也是分離原生質體的重要來源，可用於林木的遺傳轉化以及體細胞雜交研究，在理論與套用研究中具有重要的作用。體細胞胚胎具有數量多、速度快、結構完整等顯著特點，而且體細胞再生植株的優點是分化效率高、繁殖係數大、根系發達、繁殖速率比其它途徑快，因而特別適合植物的大量繁殖；由於易在體外培養，並且可以比較體外非合子胚與種子的合子胚的異同，所以廣泛用於研究植物體的生長發育過程；在基因工程研究中，將分離到的基因導入單個胚性細胞中，由這個胚性細胞長成植株的組織中，就含有整合進去的基因。
2002年4月前有關植物組織培養技術的各類文獻中，除美國有北美鵝掌楸（Liriondendron tulipiferaL.）組培相關專利技術的報導外，尚未見有雜交鵝掌楸（Liriondendron hybrid）體細胞胚胎髮生的成套技術發表。
發明內容
專利目的
《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》的主要目的是針對鵝掌楸天然結實率低，扦插困難，種苗繁殖技術無法滿足大面積植樹造林需要的現狀，尋找一種雜交鵝掌楸細胞胚胎髮生與植株再生的技術，為雜交鵝掌楸的大規模無性繁殖育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。
技術方案
《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》的主要技術特徵在於，在鵝掌楸雜交親本選擇的基礎上進行雜交，分別將正交、反交和回交制種所獲得的雜交幼胚，植於專用配方的培養基上，實現雜交鵝掌楸規模細胞胚胎的發生和植株再生。具體方法如下：
一、未成熟胚的製取
選定父、母本優良植株。四月底到五月初，在盛花期的母本植株上選擇花冠頂端微微鬆動、雌蕊柱頭布滿粘液和晶瑩亮點而即將開放的花蕾、剝開花瓣去雄，然後用鑷子從父本花朵上夾下雄蕊，從上到下輕輕觸動雌蕊柱頭，直到柱頭上塗滿一層金黃色的花粉為止，最後將花瓣合攏。七月份收集聚合翅果，製取獲得未成熟合子胚，
二、不同發育階段需要的不同基本培養基配方
1.胚性愈傷誘導階段採用1/2MS基本培養基，即將MS（Murashing and Skoog medium）培養基大量元素減半，其餘成分保持不變。附加濃度為0.5～5.0毫克/升的2,4-D，0～0.5毫克/升的6-苄胺基嘌呤（BA），500～1000毫克/升的天然複合物水解酪蛋白和1～5毫克/升的維生素C。
2.胚性愈傷組織的增殖階段，繼續使用1/2MS基本培養基。附加濃度為0～0.5毫克/升的2,4-D，0～0.25毫克/升的6-苄胺基嘌呤（BA），500～1000毫克/升的天然複合物水解酪蛋白和1～5毫克/升的維生素C。
3.胚性愈傷組織的狀態調整階段，改用MS基本培養基，並提高蔗糖濃度，附加濃度為0～0.5毫克/升的2,4-D，0～0.25毫克/升的6-苄胺基嘌呤（BA），500～1000毫克/升的天然複合物水解酪蛋白和1～5毫克/升的維生素C。
4.胚狀體的發生階段，採用MS基本培養基，適當提高細胞分裂素、特別是玉米素ZT的濃度。即附加濃度為0.5～5.0毫克/升的ZT，0～1.0毫克/升的IAA。
5.球形胚形成以後階段，採用MS改良培養基，調整MS培養基中的含氮量，直至胚狀體發育成苗。
6.幼苗發育階段，採用White培養基。
以上所涉及的各類培養基具體配方如下：
1.MS基本培養基（Murashing and Skoog medium，1962）標準配方：NH4NO31650毫克/升、KNO31900毫克/升、CaCl2·2H2O440毫克/升、MgSO4·7H2O370毫克/升、KH2PO4170毫克/升、KI0.83毫克/升、H3BO36.2毫克/升、MnSO4·H2O16.9毫克/升、ZnSO4·7H2O8.6毫克/升、Na2MoO4·2H2O0.25毫克/升、CuSO4·5H2O0.025毫克/升、CoCl2·6H2O0.025毫克/升、FeSO4·7H2O27.8毫克/升、Na2-EDTA37.3毫克/升、肌醇100毫克/升、煙酸0.5毫克/升、鹽酸硫胺素0.1毫克/升、鹽酸吡哆醇0.5毫克/升、甘氨酸2毫克/升。
2.1/2MS培養基，即大量元素減半的MS培養基（Murashing and Skoog medium，1962）標準配方：NH4NO3825毫克/升、KNO3950毫克/升、CaCl2·2H2O220毫克/升、MgSO4·7H2O185毫克/升、KH2PO485毫克/升、KI0.83毫克/升、H3BO36.2毫克/升、MnSO4·H2O16.9毫克/升、ZnSO4·7H2O8.6毫克/升、Na2MoO4·2H20.25毫克/升、CuSO4·5H2O0.025毫克/升、CoCl2·6H2O0.025毫克/升、FeSO4·7H2O27.8毫克/升、Na2-EDTA37.3毫克/升、肌醇100毫克/升、煙酸0.5毫克/升、鹽酸硫胺素0.1毫克/升、鹽酸吡哆醇0.5毫克/升、甘氨酸2毫克/升。
3.MS改良培養基配方：NH4NO31200毫克/升、KNO31000毫克/升、CaCl2·2H2O440毫克/升、MgSO4·7H2O370毫克/升、KH2PO4170毫克/升、KI0.83毫克/升、H3BO36.2毫克/升、MnSO4·H2O16.9毫克/升、ZnSO4·7H2O8.6毫克/升、Na2MoO4·2H2O0.25毫克/升、CuSO4·5H2O0.025毫克/升、CoCl2·6H2O0.025毫克/升、FeSO4·7H2O27.8毫克/升、Na2-EDTA37.3毫克/升、肌醇100毫克/升、煙酸0.5毫克/升、鹽酸硫胺素0.1毫克/升、鹽酸吡哆醇0.5毫克/升、甘氨酸2毫克/升。
4.White培養基（1964）標準配方：Ca（NO3）2·4H2O300毫克/升、KNO380毫克/升、MgSO4·7H2O740毫克/升、NaH2PO4·H2O16.5毫克/升、KI0.75毫克/升、KCl65毫克/升、Na2SO4200毫克/升、H3BO31.5毫克/升、MnSO4·4H2O7毫克/升、ZnSO4·7H2O3毫克/升、MoO30.001毫克/升、FeSO4·7H2O27.8毫克/升、Na2-EDTA37.3毫克/升、肌醇10.0毫克/升、煙酸0.1毫克/升、鹽酸硫胺素1.0毫克/升、鹽酸吡哆醇0.1毫克/升。
附圖說明
圖1為2,4-D濃度與胚性愈傷誘導率的關係曲線。圖中的橫坐標軸表示2,4-D的濃度，單位為毫克/升，縱坐標為誘導率（％）。
圖2為細胞分裂素ZT與胚狀體誘導效率之間的關係曲線。圖中的橫坐標軸表示細胞分裂素ZT的濃度，單位為毫克/升，縱坐標為誘導率（％）。
權利要求
1.《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》其特徵在於採集人工雜交授粉發育的雜交鵝掌楸聚合翅果，在無菌條件下，分離球形期至子葉期的未成熟合子胚進行體胚發生培養；體胚發生培養的不同發育階段所使用的培養基配方和附加激素配方為：
a.胚性愈傷誘導階段採用1/2MS基本培養基，附加濃度為0.5～5.0毫克/升的2,4-D，0～0.5毫克/升的6-苄胺基嘌呤（BA），500～1000毫克/升的天然複合物水解酪蛋白和1～5毫克/升的維生素C；
b.胚性愈傷組織的增殖階段，繼續使用1/2MS基本培養基。附加濃度為0～0.5毫克/升的2,4-D，0～0.25毫克/升的6-苄胺基嘌呤（BA），500～1000毫克/升的天然複合物水解酪蛋白和1～5毫克/升的維生素C；
c.胚性愈傷組織的狀態調整階段，採用MS基本培養基，蔗糖濃度控制為50～60克/升，附加濃度為0～0.5毫克/升的2,4-D，0～0.25毫克/升的6-苄胺基嘌呤（BA），500～1000毫克/升的天然複合物水解酪蛋白和1～5毫克/升的維生素C；
e.球形胚形成以後階段，採用MS改良培養基；
f.體胚植株再生階段，採用White培養基。
2.如權利要求2所述的雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術，其特徵在於：
a.胚性愈傷誘導階段，2,4-D的最佳值為1.5～3.0毫克/升；
b.胚性愈傷組織的狀態調整階段，蔗糖濃度的最佳值為60克/升；
c.胚狀體的發生階段，玉米素ZT的最佳值為2～4毫克/升。
實施方式
以下是採用《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》的典型實施例：
1.採用未成熟合子胚進行胚性愈傷組織的誘導。春季人工授粉，盛夏收集聚合翅果，將採下的聚合翅果於4℃條件下低溫冷藏4～6天，剖開且剪去翅膀。用洗潔精清洗種子，以除去其表面的油污，自來水沖洗30分鐘，蒸餾水沖洗3次，75％的乙醇處理20秒，0.1％的氯化汞4分30秒，無菌水沖洗4次。無菌狀態下，剝去種皮，將未成熟胚接入誘導培養基。
胚性愈傷誘導階段採用1/2MS培養基，附加激素是濃度分別為2,4-D0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0毫克/升，6-BA0，0.1，0.2，0.4，0.5毫克/升。添加500～1000毫克/升的天然複合物水解酪蛋白。維生素C5毫克/升，培養基中含蔗糖4％，瓊脂0.65％，滅菌前將pH調至pH5.7，121℃高溫、高壓滅菌16分鐘，培養溫度24～26℃，黑暗條件下培養，每二十天繼代培養一次。
幼胚接入誘導培養基後約15天開始啟動，長出的愈傷組織色淡，晶瑩，透明。25天左右，有些發生少許褐變，經繼代後，褐變停止，並開始長出白色快速增殖的胚性愈傷組織，10天左右的時間，即可長滿整個培養瓶。這種愈傷組織在解剖鏡下觀察，多為圓球狀，水分含量多，細胞質稀薄的薄壁細胞。
各種濃度的2,4-D均能誘導胚性愈傷組織產生，但濃度過低，胚性細胞生長太慢，濃度過高，長勢過於迅猛，胚性細胞狀態不易調整。結果表明，2,4-D1.5，2.0，3.0三種濃度較為合適。
2,4-D對胚性愈傷組織誘導的影響參見附圖1。
同時，比較了合子胚發育階段（聚合翅果採集時間）對體胚發生的影響。表1說明聚合翅果採集時間即幼胚發育階段，對體細胞胚胎的誘導起著至關重要的作用，球形期至子葉期的幼胚對體胚誘導都有效。但是採集時間過早幼胚發育不好，採集過遲胚胎已經發育成熟，都不利於體胚的誘導。
幼胚發育階段對體細胞胚胎髮生的影響參見表1。
釆集時間 | 胚性愈傷 | 胚狀體 |
6月28日 | -- | -- |
7月6日 | -- | -- |
7月13日 | -- | -- |
7月19日 | + | + |
7月26日 | + | + |
8月2日 | + | + |
8月9日 | -- | -- |
8月16日 | -- | -- |
8月23日 | -- | -- |
+表示能夠誘導體胚發生，-表示不能誘導體胚發生。
2.胚性愈傷組織的增殖階段，繼續使用1/2MS基本培養基，及時降低生長素2,4-D濃度為0，0.1，0.2，0.4，0.5毫克/升，細胞分裂素BA的濃度為0，0.1，0.25毫克/升，水解酪蛋白濃度保持不變。大量研究表明，誘導體細胞胚胎，第一階段需要高濃度的生長素，如2,4-D、NAA，此時外植體脫分化形成愈傷組織，即而誘導形成胚性細胞；第二階段體細胞胚胎的形成和發育，必須降低2,4-D的濃度或完全除去。降低外源生長素的含量，愈傷組織細胞生長速度得到控制，有利於原始胚性細胞的形成。
3.胚性愈傷組織的狀態調整，基本培養基改用MS培養基，並提高蔗糖濃度至50～60克/升以提高滲透壓，激素濃度與增殖階段相同。試驗證明，滲透壓對體細胞胚胎的形成起著重要的作用，在胚狀體形成階段，滲透壓可能達到200～400毫摩爾/千克左右。在試驗中，我們發現，隨著滲透壓的提高愈傷組織含水量逐漸減少而變得乾燥，緊密。培養一個月後，形成顆粒狀的愈傷組織，進而發育成胚狀體。說明隨著滲透壓的提高，體胚誘導能力增強。但是滲透壓過高，超出一定範圍，其誘導體細胞胚胎的能力反而下降，在該發明中，蔗糖濃度60克/升時的滲透壓為最適滲透壓。
蔗糖濃度對體胚發生的影響見表2。
類型/營養成分 | 1 | 2 | 8 | 4 | 5 |
基本培養基 | MS | MS | MS | MS | MS |
維生素C（毫克/升） | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
水解酪蛋白（毫克/升） | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
蔗糖（克/升） | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 |
愈傷狀態 | 疏鬆 | 較緊密 | 緊密 | 乾燥 | 失水死亡 |
4.胚狀體的發生，MS基本培養基，附加的激素組合分別是0.5，1.0，2.0，4.0，5.0毫克/升的ZT，0，0.1，0.5，1.0毫克/升的IAA，這時培養基中的蔗糖濃度降低為30克/升。
細胞分裂素ZT，對體細胞胚胎的形成起著重要的作用。在高濃度的生長素的作用下，細胞生長速度很快，這樣形成大量的薄壁細胞並不有利於體細胞胚胎的形成，而細胞分裂素ZT，可以中和生長素的後續效應，調整細胞狀態，減慢細胞生長速度，經過一段時間以後，愈傷組織逐漸由水浸狀變為顆粒狀，發育形成胚狀體。胚性細胞呈卵圓形，細胞核大，核仁明顯，核中移，線粒體、質體、核糖體、高爾基體、內質網等細胞器增多，澱粉粒、脂滴積累，有較活躍的自體吞噬現象，在細胞核、液泡膜、線粒體、內質網等部位有較高的ATP酶活性。並且在含ZT的培養基中，隨著ZT濃度升高，誘導率也呈梯度上升，說明ZT濃度與誘導效率存在正相關，但ZT濃度過高，也會有副作用。
ZT與胚狀體誘導效率之間的關係參見附圖2。
5.胚狀體的發育和成熟。球形胚形成以後，轉入MS改良培養基使其繼續發育，球形胚經過近兩個月的發育，會依次經過球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚階段而發育成苗。
在《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》改良培養基上，成功地調整了胚性細胞的生長狀況，使得體細胞胚胎髮生中最難的關鍵技術問題——畸形苗的發生得到有效控制，並且胚性愈傷組織上會不斷分化形成新的胚狀體，繁殖係數大，在直徑為1厘米的胚性愈傷組織上，通常可看到10～20個子葉胚發育。
另外，由於體細胞胚胎髮生具有兩極性的特點，所以，胚狀體同時形成芽和根，成為完整的幼苗，很好地解決了組織培養中生根難的問題。
6.幼苗在White培養基上發育成小植株，繼續降低蔗糖濃度為20克/升。體細胞胚胎髮生中另外一個難題是很難形成發達的根系，解決的辦法是降滲，即降低蔗糖濃度和無機鹽濃度，抑制主根過度延長，必要時可加入0.1毫克/升的IBA，這樣可以誘導根系發達的鬚根系統。
7.移苗定植階段。體胚發芽後，瓶苗長至2厘米高，且根葉發達時，從瓶中取出洗去幼苗根部培養基，植入主要由珍珠岩構成的基質中。移苗後一周內濕度保持在95～100％，一個月內的管理要特別細緻，注意濕度與溫度的協調。移苗後一個星期，可以開始葉面施肥，成活後就可以根部施肥，並按常規苗木栽培工藝進行定植。
榮譽表彰
2011年，《雜交鵝掌楸體細胞胚胎髮生與植株再生技術》獲得第七屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
