雙生病毒衛星DNA編碼的βC1蛋白抑制轉錄水平基因沉默研究

《雙生病毒衛星DNA編碼的βC1蛋白抑制轉錄水平基因沉默研究》是依託浙江大學，由謝艷擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：雙生病毒衛星DNA編碼的βC1蛋白抑制轉錄水平基因沉默研究
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：謝艷
• 項目類別：面上項目

項目摘要

本項目擬在發現雙生病毒衛星DNA編碼的βC1能抑制轉錄水平基因沉默（TGS）的基礎上，採用bisulfite sequencing檢測感病植株病毒基因組甲基化水平，比較衛星DNAβ存在與否對病毒基因組甲基化的影響；將dex誘導的βC1轉化擬南芥，採用半定量RT-PCR、甲基化敏感限制性內切酶-PCR、bisulfite sequencing和甲基化敏感單核苷酸延伸等方法研究βC1對擬南芥內源甲基化沉默基因及擬南芥全基因組甲基化的影響；通過酵母雙雜交和雙分子螢光互補試驗篩選甲基化途徑中與βC1互作的寄主因子。本項目從分子生物學和遺傳學兩方面首次探索病毒衛星DNA編碼的βC1抑制TGS的機理，研究結果將為深入剖析RNA沉默機制及病毒與寄主的互作打下理論基礎。

結題摘要

DNA甲基化是調控基因表達、抑制內源轉座子及抵抗外源入侵DNA病毒的一種基本的表觀遺傳學修飾方式。作為一種反防禦機制，雙生病毒編碼一些蛋白來抑制寄主植物的甲基化和轉錄水平基因沉默（Transcriptional gene silencing,TGS）。項目以中國番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）及其伴隨的衛星betasatellite（Tomato yellow leaf curl China betasatellite, TYLCCNB）為材料，發現TYLCCNB編碼的βC1能抑制甲基化介導的轉錄水平基因沉默。亞硫酸氫鹽測序（bisulfite sequencing）表明TYLCCNV基因組DNA在TYLCCNV單獨侵染的本氏煙中能夠發生甲基化，且甲基化主要集中於病毒啟動子區，包括基因間隔區(含有病毒複製起點和雙向轉錄啟動子)、AV2區(含有AV1/CP啟動子)以及AC2/AC3的啟動子區。衛星TYLCCNB與TYLCCNV共同侵染能夠降低TYLCCNV全基因組的甲基化水平，使其從5.4%降到1.25%。TYLCCNB能夠互補甜菜曲頂病毒（Beet curly top virus, BCTV）L2-突變體，阻止次級侵染組織發生回復，使其胞嘧啶甲基化水平降低15%左右。甲基化鏈延伸實驗表明TYLCCNB與TYLCCNV共同侵染本氏煙使寄主基因組的甲基化水平降低2.5倍左右。衛星TYLCCNB與TYLCCNV或者BCTV L2-突變體共同接種能夠回復16-TGS本氏煙中轉錄水平沉默的GFP轉基因的表達，而TYLCCNV本身並不能有效地抑制TGS。βC1蛋白能回復16-TGS 本氏煙中轉錄水平沉默的GFP轉基因的表達，並且能夠激活擬南芥中F-box 等內源表觀沉默位點的表達，顯著降低擬南芥基因組的甲基化水平。酵母雙雜交和雙分子螢光互補實驗表明βC1能夠在體內與甲基循環中的關鍵酶S-腺苷高半胍氨酸水解酶(SAHH)互作。體外SAHH活性測定試驗表明βC1與SAHH互作後能夠使SAHH的活性降低80%左右，從而抑制甲基化和TGS。