《闡釋延伸因子EF4的分子機制和生理功能》是依託清華大學，由陳春來擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：闡釋延伸因子EF4的分子機制和生理功能
- 依託單位：清華大學
- 項目負責人：陳春來
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
延伸因子EF4是細胞內最為保守的蛋白質之一，僅次於延伸因子EF-G和EF-Tu。EF4、EF-G和EF-Tu都有著類似的蛋白結構域和三維結構。EF-G和EF-Tu是翻譯過程所絕對必需的輔助因子。但EF4參與翻譯過程中的分子機制及其生理功能至今仍不清楚。.近期研究表明，EF4可與核糖體結合，並在某些條件下對蛋白表達水平起著一定的調控作用。在此，我們計畫結合先進的單分子螢光技術和新興的核糖體圖譜技術來揭示EF4的機制和功能。一方面，利用基於全內反射螢光顯微鏡的四色螢光共振能量轉移技術，從多個維度細緻表征EF4與核糖體相互作用時的結構和動力學信息，包括：EF4自身構型變化、EF4誘導的核糖體構型變化、以及相互作用時兩者之間的調控等。另一方面，利用核糖體圖譜技術在細胞層面高通量的篩選EF4在翻譯過程的功能位點。最後結合兩個層面的認知，闡述EF4的分子機制和生理功能及其兩者之間的聯繫。
結題摘要
延伸因子EF4是細胞內最為保守的蛋白之一，它與延伸因子EF-G和EF-Tu都有著類似的蛋白結構域和三維結構。但在分子水平，EF-G和EF-Tu都是翻譯過程所必需的輔助因子，而EF4則不是。在細胞水平，EF-G或EF-Tu的敲除對大腸桿菌都是致死的，而敲除EF4的大腸桿菌在適宜環境下的生長速度和蛋白表達水平與野生型的大腸桿菌無異。研究表明，EF4可與核糖體結合，並對翻譯過程起著一定的調控作用。但EF4的分子機制和生理功能至今仍不清楚。在本項目中，完成了有活性的螢光標記EF4的製備，並發展了新型的單分子螢光技術手段來捕捉EF4參與的動態生化過程，最終細緻表征了分子水平上EF4與核糖體的相互作用以及對翻譯過程的調控。在細胞水平上，篩選出使野生型和EF4敲除型的大腸桿菌出現顯著生長速度差異的抗生素，並對此抗生素生長條件下的大腸桿菌進行了轉錄組和核糖體圖譜的建庫、測序和數據分析。通過這一系列工作，本項目揭示了EF4可以與核糖體的PRE-translocation和POST-translocation狀態結合、減緩翻譯速率、並主要通過阻礙醯胺化tRNA的進入將核糖體停滯在POST狀態。以上現象從分子層面闡明了EF4可能的分子機制：EF4通過穩定並結合停滯在POST狀態的核糖體，從而保護初生肽鏈不被水解；當外界壓力消失時，POST狀態的核糖體可以繼續翻譯過程；如果外界壓力持續存在，那么POST狀態的核糖體也可以被輔助蛋白識別進入回收途徑。因此EF4是脅迫條件下核糖體和翻譯過程的保護因子。此外，本項目還開發出新型的單分子螢光顯微技術，為捕捉近生理條件的微摩爾每升濃度下、高時間分辨、長時間尺度的生物分子動態過程提供了重要的技術手段，並用以研究和揭示其它重要生物大分子機器的分子動態和機制。
