《長鏈非編碼RNA—LOCCS對結腸癌幹細胞分化的調控機制》是依託復旦大學，由鄒健擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：長鏈非編碼RNA—LOCCS對結腸癌幹細胞分化的調控機制
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：鄒健
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
腫瘤幹細胞的增殖和分化是造成腫瘤治療失敗的主要原因。在一些長鏈非編碼RNA(1ong noncoding RNA，lncRNA)內含多種miRNA的互補序列，能通過與miRNA結合的方式對其表達和活性進行調節，從而對基因進行轉錄後調控。腫瘤幹細胞中存在特異性的lncRNA，它們是保持幹細胞特性和誘導分化的關鍵分子。但是lncRNA對腫瘤幹細胞分化的調控機制尚不清楚。本研究選用結腸癌幹細胞作為研究對象，以前期篩選出的lncRNA-LOCCS分子為主線，採用報告基因、表達質粒、RNA干擾等方法作為主要研究手段，了解在結腸癌幹細胞向結腸癌細胞分化過程中，LOCCS分子對於miR-93表達和活性的影響；同時觀察其下游受調節基因HDAC8、TLE4表達的變化，探討LOCCS在人結腸癌幹細胞定向分化中的作用，試圖進一步闡明腫瘤的發生機制，並為結腸癌幹細胞標誌物的選擇及其根除治療做些探索性的工作。
結題摘要
本課題組在前期實驗中比較了結腸癌細胞株(SW1116)和結腸癌幹細胞株（SW1116csc）miRNA表達譜的差異，其中miR-93的表達具有顯著差異，miR-93能抑制SW1116csc細胞增殖和集落形成。為探索miR-93的上游調節分子及其作用機制，我們在SW1116csc細胞內篩選出一條含有miR-93互補序列的lncRNA，作為下一步實驗的研究對象，並將其命名為LOCCS（lncRNA overexpressed in colon cancer stem cells）。首先我們從結腸癌細胞SW1116中分離結腸癌幹細胞SW1116csc並傳代培養；根據LOCCS的序列設計併合成siRNA，構建和轉導pENTR/U6-siLOCCS質粒，定量PCR法檢測pENTR/U6-siLOCCS轉導SW1116csc細胞後miR-93表達水平的改變；然後合成miR-93序列，構建和轉導pGL3M-miR-93螢光素酶報告載體；再採用全基因合成方法合成LOCCS序列，構建和轉導pcDNA-LOCCS質粒，套用雙螢光素酶報告分析系統檢測內源性和外源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93的抑制作用；最後，在上調或下調LOCCS的過程中，採用定量PCR法和Western blot法檢測HDAC8、TLE4、CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1表達水平的變化，同時檢測SW1116csc細胞生長曲線和集落形成率的改變。研究結果顯示：pENTR/U6-siLOCCS質粒經測序鑑定能成功表達siRNA，定量PCR法檢測pENTR/U6-siLOCCS轉導後的SW1116csc細胞，其miR-93表達水平明顯升高。pGL3M-miR-93質粒經測序鑑定能成功表達miR-93，套用雙螢光素酶報告分析系統檢測發現內源性和外源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93具有明顯抑制作用。我們還觀察到細胞內的LOCCS水平與細胞增殖和集落形成率呈正相關。本研究證實了LOCCS在SW1116csc細胞內具有“miRNA海綿”作用，能夠吸附miR-93，降低miR-93的表達水平，在miR-93的上游對其起到調控作用。LOCCS促進細胞增殖和集落形成，與miR-93的作用正好相反。
