《鈣離子介導的HIV-1 Vpu拮抗Tetherin作用機制的研究》是依託吉林大學，由於湘暉擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：鈣離子介導的HIV-1 Vpu拮抗Tetherin作用機制的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：於湘暉
- 依託單位：吉林大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
Tetherin是人體細胞天然存在的抗病毒因子，其抗病毒機理是通過穿膜區和錨定區將新生病毒顆粒束縛在被感染細胞表面，阻止病毒釋放，其抗病毒作用可被HIV-1 Vpu拮抗，機制目前尚有爭論。本課題基於已有理論及前期研究基礎，對此問題提出一種新的解釋。即Vpu通過與TASK通道蛋白相互作用引發細胞表面電位變化，觸發電壓依賴性鈣通道（VDCC），導致鈣離子內流，激活磷脂酶C（PLC）切除Tetherin的錨定區GPI修飾，使其抗病毒活性喪失，同時釋放三磷酸肌醇（IP3）信號，進一步提升胞漿鈣離子濃度，產生級聯放大作用。本課題將通過鈣離子調控劑干預、同位素示蹤和RNA干擾等實驗手段證實GPI修飾對Tetherin功能的影響及PLC和鈣離子對其功能的阻斷作用，揭示一條通過鈣離子介導的Vpu拮抗Tetherin作用途徑，從一個全新角度闡明Vpu增強病毒釋放的分子機制，為抗愛滋病治療提供新思路和新靶點。
結題摘要
Tetherin是細胞中一種具有獨特跨膜拓撲的II型跨膜蛋白，能夠限制包括HIV-1在內的多種包膜病毒繁殖產生的子代病毒從被感染的宿主細胞中釋放出來。HIV-1VPU能夠拮抗宿主限制因子Tetherin的限制作用從而增強病毒的傳播。VPU拮抗Tetherin的分子機制初步認為：VPU誘導Tetherin的降解或者下調Tetherin細胞表面表達量。我們在本項目中提出VPU可能通過其跨膜區的特殊性質，誘導宿主細胞內鈣離子濃度上升，從而激活某些鈣離子依賴的下游通路進而拮抗Tetherin的抗病毒活性的假說，並以一系列實驗對此假說的幾個方面進行了驗證。我們通過Fluo-4鈣離子螢光指示染料作為監測細胞內鈣離子濃度的變化的方法，配合以螢光顯微鏡、螢光分管光度計以及流式細胞分析，對表達VPU的宿主細胞內鈣離子濃度進行檢測，得出明確結論：VPU能夠提升宿主細胞內鈣離子濃度。我們進一步通過多種抑制劑實驗以及siRNA沉默實驗，配合以病毒釋放測試，確定了VPU提升宿主細胞內鈣離子濃度的能力是依賴於T型電壓依賴的鈣離子通道的，並且與VPU消除Tetherin限制釋放的活性相關。我們通過定位誘變等方法，證明VPU提升細胞內鈣離子濃度的機制是通過與TASK1相互作用。對於被VPU提升的細胞內鈣離子可能通過哪種方式來起到拮抗Tetherin的作用，我們也進行了多方面探索，通過免疫共沉澱實驗確認VPU不影響Tetherin與出芽病毒的共定位。同時，我們初步發現VPU可能通過激活MMP等水解酶切割Tetherin從而消除其限制活性，而磷脂酶PLC和PLD介導的作用則相對微弱。進一步的實驗還發現，VPU通過T-VDCC介導的鈣離子濃度升高，可以干擾Tetherin的HemITAM motif磷酸化而抑制Tetherin的NF-kB活性。綜上所述，我們通過多種研究手段，初次證明了一種鈣離子介導的VPU拮抗Tetherin的新分子機制的存在，並對這種機制中的主要信號傳導途徑進行了闡明。
