《重組噬菌體對沙眼衣原體作用及機制的探索》是依託天津醫科大學，由邵麗麗擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：重組噬菌體對沙眼衣原體作用及機制的探索
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：邵麗麗
- 依託單位：天津醫科大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
沙眼衣原體泌尿生殖道感染是國內外最常見的性傳播疾病，可引起嚴重併發症。很多病人遷延難治，也沒有有效的疫苗。國際上新近認為衣原體噬菌體可能是最有希望的生物治療手段，但迄今國內外尚未發現沙眼衣原體噬菌體。課題組前期研究（國家自然基金30671879）發現具有宿主識別功能的最佳化GPIC噬菌體Vp1蛋白可特異結合在沙眼衣原體多形態膜蛋白I（Pmp I）上，產生抑制效應，並在沙眼衣原體感染患者的分泌物標本中檢測到衣原體噬菌體Vp1核酸片段。本課題擬在前期基礎上用上述兩種Vp1片段與不同類別噬菌體重組，套用本實驗室前期研製出的抗Vp1單克隆抗體和各噬菌體標記物質，結合螢光、膠體金標記，在免疫電鏡和共聚焦顯微鏡下，觀察我們構建的12種噬菌體的透膜能力、在沙眼衣原體各生活周期中的生長繁殖和分布，以及宿主沙眼衣原體被抑制、破壞的關係，探討噬菌體對沙眼衣原體可能作用機制。
結題摘要
沙眼衣原體( Chlamydia trachomatis, C.t )泌尿生殖道感染是近年來國內外最常見的性傳播疾病，抗生素耐藥與持續感染報導屢見不鮮，由於治療效果欠佳、缺少有效疫苗，探索對C.t有治療作用的生物治療手段成為研究的熱點。 在該基金的資助下，我們將VP1蛋白進行截短克隆表達，發現VP1主要作用位點可能在158-330位胺基酸區間內，是 VP1蛋白對C.t抑制的關鍵部位，其中IN5環（第216-299aa）是暴露在VP1蛋白表面的插入環，推測其可能是潛在的受體結合區域，與噬菌體對宿主的黏附、植入和識別有重要關係，表達並純化了IN5環區域蛋白，用其干預C.t培育過程，發現其對C.t生長的抑制率達52.24%。課題組利用基因重組技術，以M13噬菌體為載體，將IN5片段與M13噬菌體重組，酶切、PCR、測序、Western 印跡顯示，IN5 片段成功連線至 M13 噬菌體，並表達融合蛋白。同時合成了能穩定表達整合素結合蛋白（RGD）和IN5環的M13-RGD-IN5構建體，該構建體為有沙眼衣原體識別能力的活性擬衣原體噬菌體，CCK8檢測其對細胞無明顯毒性，RGD增加噬菌體穿透細胞膜及包涵體膜的能力，共聚焦顯微鏡觀察噬菌體在Hela細胞中的位置，發現衣原體的螢光和噬菌體螢光存在很大程度的重疊，提示噬菌體不僅進入細胞，而且進入衣原體包涵體內。M13-RGD-IN5重組體對C.t感染的抑制率達69.4%,其機制可能系衣殼蛋白中表達的IN5蛋白促進重組噬菌體與C.t識別，加速噬菌體對衣原體的侵襲過程，噬菌體引起網狀體停止分裂，不能產生新的原體，從而導致衣原體感染率降低。課題組還利用衣原體穿梭質粒技術將合成的PhiCPG1噬菌體全基因片段與衣原體部分質粒序列重組，獲得了具有生物活性重組噬菌體，能夠抑制沙眼衣原體的生長。已將合成的PhiCPG1噬菌體基因片段環化，正在將環化的PhiCPG1DNA轉入衣原體內，以期獲得有活性的天然噬菌體。 經仔細操作合成的重組噬菌體將為發病率極高的C.t感染提供精準特異、有效、沒有副作用且不影響人體微環境的生物治療手段，避免了長期套用抗菌素產生耐藥性，為解決持續性沙眼衣原體感染臨床難題奠定基礎，也為控制其他性傳播病原體提供了一種模型。
